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重组子的筛选和鉴定

省部重点实验室

2012/02/22

重组子可通过酶切进行鉴定，也可以利用扩增引物通过 PCR 进行鉴定，阳性重组子能切出所需要的片段或得到相应片段的 PCR 产物。

1. 用牙签挑取平板上的菌落接种于 2ml 含适当抗生素的 LB 培养基中，37℃摇床培养过夜。

2. 次日取菌液 0.2-0.5ml，13,000rpm×3min 离心，弃上清，加入 20μl ddH₂O 和 20μl 酚/ 氯仿，震荡混匀，13,000rpm×5min 离心。

3. 取上清进行琼脂糖电泳，加入载体质粒 DNA 作为阴性对照，根据质粒大小初步筛选重组子，重组子的泳动速度应该慢于载体质粒。

4. 用碱法小量制备可能是重组子的质粒 DNA。

5. 选取适当的酶，对重组子进行酶切分析，酶切体积均为 10μl 体系。酶切样品进行琼脂糖电泳鉴定是否有所需片段。

6. 酶切分析正确的重组子分成两份，一份进行测序反应，另外一份保种。

7. 若用 PCR 法鉴定，则在第 2 步时每个样本取 0.5-1.0μl 菌液为模板进行 PCR 反应，每管反应体系最低可少至 10μl ，PCR 产物电泳，能得到所需条带的样本进一步提取质粒酶切鉴定或送样品测序。

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