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电泳图的阅读体会-(心得)初学者必读

  • 省部重点实验室
    2012/05/05
  • 私聊

电泳仪

  • 电泳后出现异常情况,最后发现系配错胶浓度,才算有点真正理解琼脂糖凝胶电泳!或者说真正看懂书,可惜这些细节就是没人教,可能就是所谓的个人领会。在这里共享,以助初学者理解。


    本来做实验就不是专业,这几个月一边做一边学。真希望能看到高手的体会、分享。但反过来想想,要是我很懂了,可能会以为这些很简单大家都懂,也不会发帖提醒。所以在这里慢慢总结这次错误。自己思考,也希望多少对大家有帮助。

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  • 省部重点实验室

    第1楼2012/05/05

    基本概念(出现错误后才真正能理论联系实际) 

    溴化乙锭(EB)是制胶时混在胶中,载样缓冲液(含溴酚蓝染料)是电泳前才同样本混合的。


    正确电泳后拍的照片,仔细观察可以发现,点样孔侧(阴极)较白,而另一侧则较黑,两者之间有一分界线。其实显示白色的胶内含EB,而黑色的胶内则EB已迁移,所以EB是胶呈白色的原因。此分界线为EB在电场作用下向阴极移动的前沿。分界线的点样孔侧有一排黑色条带,只有在点过样本的点样孔列出现,无样本的列则无此黑色条带。此黑色条带为溴酚蓝在照片中的位置。

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  • 省部重点实验室

    第2楼2012/05/05

    电泳时,点样孔侧通常为阴极,而对侧则为阳极。蛋白带负电荷,所以向阳极移动,溴酚蓝也带负电荷,同样向阳极移动。溴酚蓝在不同浓度的胶内的移动速度是不同的。在0.5-1.4%浓度、0.5 X TBE的胶内其移动速率约与300bp的线状双链DNA相似。但我用的胶是3%,所以与书上不同,与更小bp的线状双链DNA相似。胶内的EB带正电荷,向阴极也就是点样孔侧移动。溴酚蓝是在电泳时起到指示电泳带的作用,就是肉眼在胶上看到时的染色条带,而EB与DNA结合才是在紫外线下发光的原因。如果电泳时间过长,会导致EB向阴极移动过多,甚至全部跑出凝胶。这样的话,含样本条带的胶内没有EB,在紫外线下电泳条带就不能发光。

    错误就这样发生了,配错胶浓度,可能是1.5%,导致在同以前一样的电泳时间内,条带跑得更远,跑到EB已经向阴极移走,所以不含或含很少EB的胶内,于是在紫外线下看不到条带。

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  • 省部重点实验室

    第3楼2012/05/05

    这时想要补救,以显示条带,就需要在含0.5ug/ml溴化乙锭(EB)液中浸泡约30-45分钟。


    因为与DNA结合的EB呈现更高的荧光,比游离在胶中的EB发的荧光高出20-30倍,所以条带会比背景亮。在EB存在的情况下,线状DNA的电泳迁移率降低15%,其实当凝胶中没有EB时,凝胶中的DNA条带更清楚。在胶中掺EB是为了节约时间,电泳结束马上可以看到结果。


    有时候电泳照片拍得好,在溴酚蓝远侧还可见到与溴酚蓝条带平行的稀疏的暗区,但是Marker处是没有的,这个条带是什么?二甲苯氰FF应该在近侧,而且Marker中含二甲苯氰FF和甘油。是蔗糖,Ficoll?目前不敢确认。


    凝胶浓度不同时Marker在照片上的排列也有变化,像我做错了胶,浓度低了,Marker的明显表现就是第一条带离点样孔远了好多。这个现象有助于及时找到错误原因,就是胶的浓度问题。其它电泳缓冲液错误的表现就得等再出错才知道了。也请有出过此类错误的朋友提个醒。

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  • huanshi185

    第4楼2012/08/26

    说几句我的看法吧

    1. 一般大家都用1%的琼脂糖,其实很少用其他的,所以一般不会出现配胶的浓度问题。
    2. 即使配错了,问题也不大,一般还是建议看看溴酚蓝的条带,大约300bp,有的上样缓冲液中有二甲苯氰,大约4kb,一般根据这两个条带大致做个判断
    3. 关于电泳缓冲液错误,这个真没遇到过,一般跑胶这一部分都是以污染区处理的,大家也知道EB的潜在致癌性,所以都是专用;如果出现错误,关键要看你用那个的溶液导电性的问题,TAE、TBE都可以,就是一个缓冲能力的问题,另外缓冲液离子浓度高,会导致整个电场强度比较大,电泳速度快,发热高,这个要注意。

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