天天想你
第3楼2012/03/09
作为生命的基本结构单元,氨基酸也有手性之分。也就是说,生命最基本的东西也有左右之分。
惊人的发现---组成地球生命体的几乎都是左旋氨基酸,而没有右旋氨基酸
我们已经发现的氨基酸有20多个种类,除了最简单的甘氨酸以外,其它氨基酸都有另一种手性对映体!那么,是不是所有的氨基酸都是手性的呢?答案是肯定的,检验手性的最好方法就是,让一束偏振光通过它,使偏振光发生左旋的是左旋氨基酸,反之则是右旋氨基酸。通过这种方法的检验,人们发现了一个令人震惊的事实,那就是除了少数动物或昆虫的特定器官内含有少量的右旋氨基酸之外,组成地球生命体的几乎都是左旋氨基酸,而没有右旋氨基酸!
右旋分子是人体生命的克星!
因为人是由左旋氨基酸组成的生命体,它不能很好地代谢右旋分子,所以食用含有右旋分子的药物就会成为负担,甚至造成对生命体的损害。
在手性药物未被人们认识以前,欧洲一些医生曾给孕妇服用没有经过拆分的消旋体药物作为镇痛药或止咳药,很多孕妇服用后,生出了无头或缺腿的先天畸形儿,有的胎儿没有胳膊,手长在肩膀上,模样非常恐怖。仅仅4年时间,世界范围内诞生了1.2万多名畸形的“海豹婴儿”。这就是被称为“反应停”的惨剧。后来经过研究发现,反应停的R体有镇静作用,但是S-对映体对胚胎有很强的致畸作用。
正是有了60年代的这个教训,所以现在的药物在研制成功后,都要经过严格的生物活性和毒性试验,以避免其中所含的另一种手性分子对人体的危害。
在化学合成中,这两种分子出现的比例是相等的,所以对于医药公司来说,他们每生产一公斤药物,还要费尽周折,把另一半分离出来。如果无法为它们找到使用价值的话,它们就只能是废物。在环境保护法规日益严厉的时代,这些废品也不能被随意处置,考虑到可能对公众健康产生的危害,这些工业垃圾的处理也是一笔不小的开支。
因此,医药公司急切地寻找一种方法来解决这个问题,比如,他想要左旋分子,那么他就得想办法把另一半右旋分子转化成左旋分子。现在,这个令人头痛的问题已经得到了解决。科学家用一种叫做“不对称催化合成”的方法解决了这一问题。这个方法可以广泛地应用于制药、香精和甜味剂等化学行业,给工业生产一下子带来了巨大的好处,这项研究也获得了2001年度的诺贝尔化学奖。
省部重点实验室
第7楼2012/03/17
手性色谱柱(Chiral HPLC Column):
手性色谱柱(Chiral HPLC Column)是由具有光学活性的单体,键合在硅胶或其它聚合物上制成手性固定相(Chiral Stationary Phase)。通过引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异,从而达到光学异构体分离的目的。主要有刷(Brush)型或称为Prikle型、纤维素(Cellulose)型、环糊精(Cyclodextrin)型、大环抗生素(Macrocyclic antibiotics)型、蛋白质(Protein)型、配位交换(Ligand exchange)型、冠醚(Crown ethers)型等类型,此类色谱柱可用于正相系统与反相系统,多用于正相系统。
常用的是蛋白质(Protein)型,其分离依赖于疏水相互作用和极性相互作用,大多可用于反相色谱条件。目前使用较多的是α-酸性糖蛋白(α-Acid Glycoprotein,AGP)、人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)和卵类粘蛋白(Ovomucoid,OV)。
α-酸性糖蛋白分子共价键合到硅胶上,制成的AGP手性色谱柱,可以分离多种手性化合物,特别针对性设计应用于在反相条件下的使用;而HSA及BSA手性柱,多键合在环糊精型担体上,亦常用于反相色谱条件,其使用与保养基本同反相柱,且可以保存在纯乙腈等有机溶剂中,使用与保养无特殊要求,应用范围较广,使用也较为方便。
由于手性柱一般都较为昂贵,使用不当又极易导致损坏,且再生尤其困难,所以使用、维护与保养均需特别慎重,必须严格按照本SOP及相应说明书进行。对于新的手性柱,使用、老化与保养程序基本类似,但由于制造商工艺条件各异,需要根据不同基质特点分析,参照并严格按照相应说明书进行处理。
一般(以AGP柱为例)主要程序如下:
(1)将色谱柱接到色谱仪器之前,必须先用合适的溶剂冲洗流路(包括六通阀和定量环)。绝对杜绝流路中残存丙酮、氯仿、DMF(二甲基甲酰胺)、DMSO(二甲基亚砜)、乙酸乙酯、二氯甲烷、THF(四氢呋喃)等,以防止破坏手性固定相。如果在进样检测,进样间隔的洗针液必须更换成合适的溶剂,最好是15%~20%的异丙醇溶液。然后连接好色谱柱,不接检测器,用纯水以0.5ml/min流速冲洗约20min。(注意:流速需小间隔从0升至0.5ml/min)
(2)连接检测器,再用纯水以0.5ml/min流速冲洗约120min。
(3)用15%以内的异丙醇溶液以0.5ml/min流速冲洗约60min。
(4)再用纯水以0.5ml/min流速冲洗约60min。
(5)用流动相以不超过0.8ml/min流速平衡约1h直至基线平稳,进样检测。
(6)分析完毕,用纯水以0.5ml/min流速冲洗约60min,以彻底洗出缓冲盐,然后用15%以内的异丙醇溶液以0.5ml/min流速冲洗约30min,密封,保存于10℃左右环境中,登记备案。
(7)特别注意:
①必须确保柱压在50bar~100bar之间,一定不要超过100bar。流速一般不大于0.8ml/min,具体应以不超过色谱柱使用压力上限为准。升高或降低流速均需以小间隔逐步升高或降低。
②提倡在室温下使用,但一般要求柱温不超过25℃。
③要特别注意流动相及样品溶解溶液的pH值,最佳pH范围为4.0~7.0,切不可超过10.0,以防止硅胶溶解而损坏填料,所以pH最好不要超过8.0。否则,极易导致手性分离不佳、色谱峰严重变宽、色谱峰拖尾及分叉等。强碱性溶液的导入,尤其容易导致手性柱不可逆损坏,无再生可能而彻底报废!
④以上(1)~(6)是在反相条件下使用情况,如果要换成正相使用,必需先用100%异丙醇以0.5ml/min流速冲洗约30min过渡,其他要求同上。
⑤色谱柱保存时,必需保证柱内无缓冲盐或其他盐类物质残存。
⑥手性柱在使用过多次且正常后,可简化上述程序,将时间适当缩短即可。
(8)特别建议:
①当分离分析酸碱性手性化合物时,有必要在流动相加入少量电荷迁移添加剂(浓度不超过10mMol/L)来提高手性柱的手性选择性。常见的有:分离酸性化合物时,添加酸性添加剂[如三氟乙酸(TFA) 、乙酸(Acetic acid) 、甲酸(Methanoic acid)、七氟乙酸(HFBA)、辛酸(OA)],浓度0.01%~0.5%;分离碱性化合物时,添加碱性添加剂[如二乙胺(DAE) 、三乙胺(TAE)、丁胺(Butyl amine,BAE) 、乙醇胺(Ethanol amine,EthAE)、N,N-二甲胺(DMOA)],浓度0.01%~0.5%。
②辛酸(OA)及N,N-二甲胺(DMOA)与水的互溶性有限,在常温下,仅仅2mMol/L(OA)或5mMol/L(DMOA)能均一的溶解于水中,若超此限度,将分层。因此,需特别注意两者水溶液的浓度。
③由于上述电荷迁移添加剂与手性柱柱床有很好的亲和力,难以从柱上洗除,长期使用可能会导致柱性能下降。因此,建议添加上述电荷迁移添加剂使用后的手性柱应作为某一品种分析专用柱。
(9)特别说明:
①部分手性柱(以AGP柱为例)使用前要求用10mMol/L的醋酸铵缓冲液(Ammonium acetrate Buffer,冰醋酸调pH至5.8)-异丙醇(2-PrOH)(95:5)进行预平衡。操作程序基本同上,不同在于:需先用纯化水以0.5ml/min流速冲洗色谱柱30倍柱体积以上→再用10mMol/L的醋酸铵缓冲液(Ammonium acetrate Buffer,冰醋酸调pH至5.8)-异丙醇(2-PrOH)(95:5)以0.5ml/min流速冲洗色谱柱30倍柱体积以上→然后用纯化水以0.5ml/min流速冲洗色谱柱10倍柱体积以上→最后用流动相平衡1h以上,进样检测即可。分析完毕,净化保养程序同上(1)~(6)。
②部分HSA及BSA手性柱,使用保养程序较为简易。即先用水-有机相(95:5或100:0),小间隔升高流速至0.5或1ml/min,冲洗约30倍柱体积→再用流动相平衡1h左右,进样检测即可。分析完毕,用水-有机相(95:5或100:0),小间隔升高流速至0.5或1ml/min,冲洗约30倍柱体积→然后用100%有机溶剂(一般多用乙腈)同流速冲洗约10倍柱体积→再以小间隔将流速降至0→密封,保存即可。