聚合柱的再生 用来分离生物分子的聚合柱也会被污染而需要清洗。这种聚合材料的化学稳定性往往决定于它们的强度。实际上,许多的生产商推荐用1.0M的硝酸或1.0M的氢氧化钠来清洗聚合柱。某些反相聚合物柱子如聚乙烯填料(苯乙烯——二乙烯基苯)(PS-DVB)和聚合整体柱如CIM RP-SDVB的叠片柱(BIA Seperations, Ljublijana, Slovenia)以及Swift色谱柱(Isco, Lincoln, Nebraska)可以承受较宽的pH值范围(通常为1~13,有时为0~14),但是,使用者在用一些要求苛刻的有机试剂清洗色谱柱时应该谨慎。根据它们键交联度,当色谱柱暴露在有些有机溶剂中时,会使色谱柱填料产生收缩或膨胀。8—10%以上的高交联度的聚合填料通常具有非常良好的机械稳定性,在水相溶剂中有最小程度的收缩,而在有机溶剂中有最小程度的膨胀。在用一系列溶剂清洗聚合柱之前,最好能够参阅色谱柱手册,或同色谱柱生产商的技术支持部门进行商讨。 按照BIA分离要求(11),使用者再生PS-DVB的聚合物整体柱可以通过: l 用10个柱体积的含0.1%的三氟乙酸的异丙醇,以一半的工作流速进行冲洗柱子; l 用至少5个柱体积的100%流动相B以一半的工作流速进行冲洗柱子; l 用至少10个柱体积的100%的流动相A以工作流速重新平衡色谱柱。 如果要清洗一根有丁基和乙基的甲基丙烯酸填料的整体柱,可以用10倍柱体积的每份含1.0M的氢氧化钠、水、20%的乙醇溶液和缓冲液,反方向冲洗色谱柱(12),并将蛋白质除去。对于大部分的亲水性蛋白质,使用者应在用水清洗之后加入一个用异丙醇(30%V/V)或乙醇(70%V/V)的清洗步骤。 对于微生物污染的清除和钝化,一根PS-DVB整体柱可以用0.5~1.0M的氢氧化钠完全清洗。装填的整体柱应该在室温下用氢氧化钠浸泡至少一个小时以上。 用来分离复杂蛋白质如不溶性的细胞膜蛋白、结构蛋白和病毒外壳蛋白的传统聚合填料的色谱柱只需粗糙的清洗条件。例如,清洗这些复杂蛋白质(13)也许要在60 °C条件下用到含3M盐酸胍的50%的异丙醇。 肽的合成中来自于固定相树脂的碎片,产生了活性碳正离子,这些碳正离子可以用苯甲醚和硫代苯甲醚来提取。这些碳正离子反应会产生大量的芳香分子,这些芳香分子会在肽的纯化中破坏反相色谱柱。这些污染物在C18柱内有很强的保留,不能用100%的乙睛或甲醇除去。为了清洗这些色谱柱,应该颠倒色谱柱的使用方向,然后用3~5个柱体积的100%异丙醇,3~5个柱体积的二氯甲烷,3~5个柱体积的异丙醇,再回到原来的初始溶剂系统进行冲洗(14)。芳香性杂质的洗脱可以用紫外检测器在260nm波长下进行核实。 |
省部重点实验室
第2楼2012/03/15
氧化锆基质的高效液相色谱柱的再生
ZirChrom 分离有限公司(Anoka,Minnesota)已经生产了一系列的氧化锆柱。其生产线也包括了一些反相液相色谱柱,如聚丁二烯、聚苯乙烯、石墨碳等形式。氧化锆要比硅胶更抗pH值,所以涂敷了氧化锆的色谱柱有更高的耐受性,能够经受住苛刻的操作环境,如高的pH值和操作温度。然而由于这些特殊的表面特性,分析者必须保持特定的分析条件以使他们的色谱柱成功地接受各种分析工作。碳酸、氟化物、磷酸根离子都会强烈地吸附在氧化锆柱上。
为了将它们从色谱柱中清除,需用50倍柱体积的20%乙睛—0.1M氢氧化钠或0.1M的四甲基氢氧化铵,10倍柱体积的水,50倍柱体积的20%乙睛-0.1M硝酸,再用10倍柱体积的水,20倍柱体积的100%的有机溶剂进行冲洗。对于聚丁二烯和聚苯乙烯柱,色谱工作者可以用甲醇、乙睛、异丙醇或四氢呋喃。石墨碳色谱柱则需要在相同的溶剂中至少加入20%的四氢呋喃(15)。
总结
反相液相色谱柱会由于一些含强保留成分的样品基体的反复进样而造成污染,尤其是一些分子量高的、亲水性比较强的化合物、如蛋白质这样的生物流动性组成和一些会吸附在硅醇基上的强碱性物质。另外,某些流动相添加试剂如离子对试剂和表面活性剂会吸附在填料表面并改变其性质。被污染的色谱柱会产生糟糕的峰形、假的可重复的保留性、高的反压力和基线干扰。通常一些能够破坏污染物与色谱柱键合或硅胶表面反应的有机溶剂和试剂可以用来清洗色谱柱。
色谱工作者需要小心谨慎,因为这些试剂本身有很强的破坏作用,使用时会造成固定相本身的损坏。此外,通过使用样品的前处理过程,尽可能少地接触到污染物的样品,来防止色谱柱受污染是一个很好的步骤。在所有的应用中,本人强烈推荐使用保护柱来防止色谱柱的污染并对分析柱可能造成的伤害。