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第1楼2012/04/11
第一章 概 论
第一节 食品安全的总趋势
食品是人类赖以生存和发展的物质基础。从预防医学角度研究食品安全卫生质量、防止食品中可能存在的威胁人体健康的有害因素是食品卫生工作者的任务,安全卫生检验方法则是执行任务的必要工具。食品中出现的有害物质,可能是食品生产、加工、储藏、运输和烹调过程中混入的,或来自外界污染,或天然存在于食品中,或由于食品某些成分在某些条件下生成的。目前,全球食品安全形势不容乐观[1~3]。主要表现为食源性疾病不断上升、恶性食品污染事件接二连三出现、食品生产加工新技术与新工艺带来新的危害以及世界范围内由于食品安全卫生质量而引起的食品贸易纠纷不断。这些问题已成为影响各国经济发展、国际贸易以及国家声誉的重要因素。近年来,世界卫生组织(WHO)和联合国粮食与农业组织(FAO)以及世界各国均加强了食品安全工作,包括机构设置、强化或调整政策法规、监督管理和科技投入。2000年WHO第53届世界卫生大会首次通过了有关加强食品安全的决议,将食品安全列为WHO的工作重点和最优先解决的领域。近年来,各国政府纷纷采取措施,建立和完善管理机构体系和法规制度。美国、欧洲等发达国家不仅对食品原料、加工品有较为完善的标准与检测体系,而且对食品生产的环境以及食物生产对环境的影响也相应的标准、检测体系及有关法律法规。西方发达国家还以食品安全作为贸易壁垒,在进出口贸易中维护本国经济利益。食品安全
问题不仅是公共卫生问题,还影响到农业与食品工业产业结构调整。近年来,“生态农业”、“无公害食品”、“有机食品”等的出台,更进一步反映了社会对食品安全、环境质量和人体健康的关注与迫切要求。食品的化学安全性问题是人们关注的热门课题。据估计,人类85%~90%的肿瘤为环境因素所致。通过食物链的富集,人类从食品中摄取了种类繁多且浓度高于环境浓度的有毒、有害物质,而这些有害物质的化学结构与性质经动植物体后变得更为复杂。随着科学的发展与社会的进步,越来越多的化学
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色谱在食品安全分析中的应用物质进入人类的生产和生活环境,其中包括食品加工中直接使用的食品添加剂、食品包装材料以及在农业上施用的农药、兽药、化肥、饲料添加剂等。而这些化学品的安全性评价与在动植物体内残留规律及其对健康的危害尚有待深
入研究。无论是安全性评价还是监督控制食品污染和保证食品质量,化学分析方法是必不可少的有效手段。食品安全化学分析概括起来分为两类,即元素分析和有机分析。元素分析多采用原子吸收光谱法、原子荧光法、电化学法、感应耦合等离子体发射光谱法等。有机分析在样品前处理和测定中,主要采用各种色谱技术。
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第二节 食品安全化学分析的国际趋势
第一,1953年世界卫生大会注意到食品工业中各种化学物质日益增长,将会产生新的公共卫生问题。对此,世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)共同组织了两个系列年会[4]。一个是食品添加剂联合专家委员会(JECFA),于1956年召开第一次会议;另一个是农药残留联席会(JMPR),第一次会议于1963年举行。1962年国际食品法典委员会(CAC)成立,其下属机构中食品添加剂和污染物法典委员会(CCFAC)、农药残留法典委员会(CCPR)、食品中兽药残留法典委员会(CCRVDF)及分析方法和采样法典委员会(CCMAS)等,皆对食品检验方法提出要求。JECFA对添加剂和污染物评价意见为CCFAC所采纳,已评价了700余种化学物质和20种污染物。JMPR已评价200种农药,为CCPR确定最大残留限量(MRL)提供了科学依据和建议。确定某化学物质在食品中限量标准的同时,也对其检验方法提出灵敏度的要求。
第二,准确、可靠的检验结果是正确评价和保证食品安全性的先决条件,也是国际贸易上公平交易的有力凭证。特别是食品污染问题,由于它们的复杂性和其对人类的影响,要求有鉴定和检测各种化学污染物的分析方法。随着科学技术的发展,不断产生和发现的新问题使人类对各种污染物的毒性和致癌性有了更加深入的认识。因而要求食品中污染物允许限量低至mg/kg(如农药、重金属等)、μg/kg (如霉菌毒素、多氯联苯、苯并芘等),甚至小到ng/kg或pg/kg (如二 英),从而要求使用相应的痕量和/或超痕量分析方法。对于食品样品中这些化学污染物的分离、分析可采用各种色谱技术,有些与质谱、光谱联用以确证在复杂组分中存在的痕量或超痕量的目标物。保健食品的安全性在国际上也受到关注,不少功能性成分的检测方法采用了色谱技术。
第三,近年来,国际上对检验质量保证体系的共识是:一个试验室必须采用适当的办法以保证所提供的数据的质量。CAC准则中要求各成员国试验室
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第一章 概论
严格地符合质量要求。对试验室的质量要求为:按ISO/IEC导则17025或其派生的准则认可;参加能力考核计划;采用内部质量控制程序;采用确认的分析方法。为了保证检验结果的正确、可靠,监测和检测工作必须在质量保证体系中进行。从样品采集至数据报告,均应有详细的实施细则,整个操作过程要求标准化。
第四,全球食品污染监测实施。1974年联合国环境规划署(UNEP)在肯尼亚内罗毕召开会议,建议在食品和饲料中进行污染物监测。同年WHO和FAO 制定了食品污染监测规划,即全球环境监测规划/食品(GEMS/FOOD),1976年开始实施。中国于1981年参加了这一规划,中国疾病预防控制中心营养与食品安全所(前身为中国预防医学科学院营养与食品卫生研究
所)被指定为WHO食品污染监测合作中心(中国)。监测目标物主要为化学污染物,即农药、工业化学污染物和天然毒素。为了保证监测数据的质量,不定期进行全球质量考核,从而促进了各成员国食品检验水平。第五,食品分析化学中突出的问题,主要表现在以下几方面。
(1)分离、分析技术 食品分析与其他领域化学分析的不同在于食品样品基质极为复杂。在食品品质、成分和污染物的检测中,有机污染物分析存在更多难题[5]。在食品样品中,某种有机污染物常伴有多种同系物、异构体,而它们的毒性或致癌性差别甚大,要求辨别、分离和测定,这样就增加了分析的复杂性。样品中目标物含量极微,而同时共存的大量干扰物必须除去。为此,采用多种分离技术以高度净化样品。有机污染物分析方法多为色谱法。色谱法分离效率高,灵敏度高,选择性好,适用范围广,分析速度快,已成为常规技术。而色谱与各种检测技术联用在有机污染物定性、定量分析中具有其独特优越性,是某些有机污染物痕量和超痕量分析的公认方法。
(2)分析方法确认 近年来,国际分析化学领域热衷于分析方法确认指标的研究[6~8]。CAC下属的CCMAS的年会多次讨论有关检验方法的评价和确认要求。ISO、IUPAC和AOACInt合作编写和发表了有关的论述,CCMAS年会(1997)讨论了分析方法的评价和确认要求。评价分析方法的操作特性(performancechracteristics)包括:精密度(precision)[重复性(repeatability)和再现性(reproducibility)]、准确度(accuracy) [回收率(recovery)]、选择性(selectivity)和基质影响(matrixeffects)、检测限/测定限(LOD/LOQ)、线性(linearity)与范围(range)和稳定性(robustness)/耐用性(ruggedness)。对每一特性规定了做法,包括最少样品数、测定次数等。不是所有分析方法均需按照上述操作参数全面确认,应根据分析方法的应用目的选择适宜的操作参数。在食品化学分析中,LOD/LOQ 对常量成分分析意义不
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色谱在食品安全分析中的应用大。在低水平污染物(重金属、农药、兽药及真菌毒素等)痕量分析时,LOD/LOQ为重要的性能指标。(3)痕量分析结果的表述 全球食品污染物监测的检测数据表述要求:样品未检出目标物,不应表述“未检出”。在报告数据的同时,必须表明所用检验方法的LOD和LOQ。若样品分析未检出目标物,则应报告样品中目标物浓度< LOD。在估算某国或某地区某类食品中某污染物的污染水平时,从统计学角度考虑,规定了统一估算方法[9]。在农药最大残留限量标准中,可以看
到在某种食品中某种农药最大残留限量为其方法的LOQ,而非“不得检出”,即表示该食品中某农药残留量不得超过方法的LOQ。
第三节 我国食品安全化学检验技术
一、食物成分及其检验方法
中国食物营养成分的研究工作始于20世纪20年代。此后,出版了《北京食物成分》和《上海食物》,较系统地分析了各种食物成分和一般元素含量。建国初期,引用当时国外先进技术和方法,建立了6种维生素含量测定方法,样品前处理已采用了柱色谱技术。此后不久,研究我国发酵食品中维生素B12时,采用了柱和纸色谱[10,11]。在20世纪50年代,完成了一部300余种食物且项目较齐全的《食物成分表》。1954年出版了《食物成分测定方法》,1961年修订后为第二版[12]。以后数次修订、再版,并成为国家标准方法。在2003年,将“食物成分测定方法”并入GB/T5009 《食品卫生检验方法·理化部
分》。在新版中,维生素A、胡萝卜素、维生素E和维生素K测定方法的第一法皆为高效液相色谱法(HPLC)。
二、卫生标准和相应的检验方法
建国以来,根据需要曾陆续颁布过单项食品卫生标准和管理办法。20世纪70年代初,我国食品污染情况不明,尚无系统制定标准。1973年卫生部制定了食品卫生科研规划,组织全国卫生防疫站、医学院校与有关部门协作,制定了我国第一部食品卫生标准,共14类54项卫生标准和12个卫生管理办法,经国务院批准,国家标准局发布,于1978年执行。与此同时,颁布了食品卫生检验方法。1978年完成了第一部部颁食品卫生理化检验方法。1986年修订颁布了国家标准GB5009 《食品卫生检验方法———理化部分》,1996年再次修订,GB/T5009 《食品卫生检验方法———理化部分》(第二版)。2001~2002年对《食品卫生检验方法———理化部分》再次修订、增订,由1996版检测71 项(仅指1996版GB/T5009,散在的标准方法未计在内)扩展到202项,并于2003年颁布[13]。在新版中,元素分析方法皆以原子吸收分光光度法或原子荧光法为第一法(仲裁法)。有机分析方法如农药残留测定方法以色谱法为主,删除了个别不适用的方法。适时地增订了克仑特罗和氯丙醇的检测方法,其第一法皆为当前国际公认的稳定性同位素为内标的GCMS法。
三、保健食品的安全性及功效成分检验方法
近年来,保健食品行业异军突起,截至2001年底,卫生部已经批准4000多种保健食品产品。保健食品产业的发展不仅为国民经济带来新的增长点,而且在出口食品中占有一定比例。不少原料成分作为药物可以应用,但作为保健食品长期食用,其安全性是值得关注的,其中不少传统药用成分并未经过系统的毒理学评价。此外,由于环境污染进而造成的淡水湖泊中藻类污染问题也已引起了广泛关注,藻类作为保健食品原料被广泛应用,因而对保健食品的安全性提出了挑战。因此,保健食品的安全性已成为十分重要的食品安全问题。随着保健食品的发展,保健食品中功效成分的检验方法应运而生,一些测定方法采用了色谱技术。本书中第十二章对保健食品中功效成分的色谱分析方法给予系统介绍。
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第四节 色谱技术在食品安全分析中的地位和展望
一、色谱技术特点和分类
(1)特点 色谱法为一种物理分离方法。其原理是利用混合物中各组分在两相中(一个相为固定相,另一个相为流动相)不同程度地分布。流动相流经固定相,使各组分以不同速度移动,从而达到分离。
(2)分类 以操作形式、两相状态以及分离机理分类。
① 以操作形式分类 固定相装于柱内的色谱称为柱色谱,如气相色谱、高效液相色谱等;而固定相呈平面状的色谱称为平面色谱,如纸色谱、薄层色谱等。
② 以两相状态分类 流动相为气体的色谱称为气相色谱,依固定相为吸附型和分配型又可分为气固色谱和气液色谱,后者为气相色谱中主流;流动相为液体的色谱称为液相色谱;流动相为超临界流体的色谱,称为超临界流体
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色谱在食品安全分析中的应用色谱。③ 以分离机理分类 可分为吸附色谱、分配色谱、凝胶渗透色谱、亲和色谱和离子色谱等。
(3)食品分析中应用 色谱技术在食品分析中应用极为广泛,依目标物的物理化学性质而采用不同的色谱法
二、色谱技术在食品安全分析中的地位
在样品前处理和测定中,有机分析主要采用各种色谱技术。作为样品前处理技术各种柱色谱是传统的净化技术,仍为最普遍应用的手段;基于液相色谱原理发展起来的固相萃取(SPE)系列,已广泛应用于食品化学分析领域;免疫亲和色谱虽有潜力,但尚待发展。此外,还有适合脂质食品样品净化的凝胶渗透色谱(GPC)等。测定方法向多种类、多组分分析方法发展,核心技术为色谱法。农药残留的检测已从单个化合物的检测发展到可以同时检测数十种甚至上百种化合物的多组分残留系统分析;兽药残留的检测也
向此类分析发展。目前国际上最具代表性的多组分残留分析方法主要有美国FDA的农药多组分残留分析方法[14]。为了适用于不同基质样品的分析,将农药残留分析的主要步骤:样品的采集、制备、萃取、净化、浓缩、分析、确证等各步骤采用的不同方法建成不同的模块,根据样品及分析要求的不同,组合成不同的处理分析流程,从而建立起一个多组分残留检测选择检索程序的前处理技术平台,使复杂的技术流程简化且又有分析质量保证。鉴于某些化学污染物的高度危害和在环境和生物体内难降解性造成的在食品和人体蓄积,2001年5月被列入斯德哥尔摩公约规定限制或禁止的环境持久性有机污染物(POPs)有12种。其中3种为二 英及其类似物(包括共平面多氯联苯),检测方法灵敏度的要求为超痕量水平(10-12~10-15g),需要用高分辨气相色谱高分辨质谱分析,采用稳定性同位素稀释技术的严格质量控制手段。激素和克伦特罗等检测也从运动员兴奋剂检测领域向食品禁用兽药监控的确证技术发展。多环芳烃类和亚硝基化合物两大类致癌物的分析方法皆采用色谱法。此外,食品添加剂和保健食品中功能性成分分析也多为色谱法。上述分析是有针对性的目标物分析。对于食品中未知毒物的研究,多在生物试验指导下,以各种色谱技术为分离手段,再以其他仪器分析技术来鉴定和测定。如杂环胺的发现,主要借助Ames致突变试验与HPLC相结合获得的物质,经波谱分析鉴定证实其结构[15]。又如食用酵米面引起的食物中毒,经动物试验与一系列化学分离、鉴定,查明引起中毒的原因是酵米面黄杆菌产生的黄杆菌毒素;这里主要采用葡聚糖凝胶柱和C18反相柱色谱分离、制备[16]。再如,变质甘蔗节菱孢毒性物质也是通过动物试验与制备TLC相结合发现的,分离出的毒物经鉴定为3硝基丙酸[17]。以各种色谱/波谱手段和同位素示踪技术相结合,进行农药杀虫双代谢毒理学研究,分离、鉴定代谢产物的结构,阐明其代谢途径,为制定食品中杀虫双最大残留限量(MRL)提供了科学依据[18]。
三、展望
色谱技术是食品样品复杂基质中微量、痕量目标物分离、富集和测定的有力工具,也是食源性疾病病因和代谢毒理学研究的重要手段。随着科技向纵深发展,人们对食品安全认识和要求与日俱增。由于目标物含量极低,同时又有毒性或致突变、致癌性差异极大的同系物、异构体的存在,以一种分析仪器解决复杂对象的分析已不可能了。在食品安全领域,色谱与其他仪器联用技术已成为现代食品化学分析的主要方向,分离、分析技术始终向着灵敏、准确、快速、简便的方向发展。
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第二章 样品前处理技术
第一节 概 述
在食品检验过程中,除了选择准确、可靠的测定方法,还应重视食品样品采集的代表性和样品前处理的合理性,它们关系到最终检验结果的正确性。对于食品样品的代表性,从统计学上有一定的要求,有关文件、书刊皆可见到这方面的内容,如CCMAS文件和我国国家标准(GB/T5009—2003)。鉴于此问题不在本书讨论的范围,这里不再赘述。食品化学分析中第一步就是从食品样品中萃取、净化和/或浓缩目标物,特别是食品样品在进行色谱分析之前尤为重要。食品样品基质比其他性质样品(如水、土、气等)复杂得多,因而食品样品前处理方法,包括萃取、净化等步骤,有其特殊性。在食品品质、成分和污染物的检测中,有机污染物分析存在更多难题[1]。其突出的问题是:①根据目标物的毒性、致突变性、致癌性的强弱,它们在食品中的允许限量为mg/kg、μg/kg、ng/kg或更低,因而要求高灵敏度的测定方法,即在1kg食品样品中要求能检出10-3g、10-6g、
10-9g或更低含量的目标物。②食品样品基质与目标物含量相差百万倍、千万倍甚至亿倍,在此情况下,由样品中萃取目标物,应尽量减少共萃取物,选择适宜的溶剂是十分重要的。③在样品萃取液中有干扰分析的共萃取物存在,增加了分析的复杂性。样品中目标物含量极微,同时共存的大量干扰物必须除去。为此,采用多种分离技术以高度地净化样品,这是现代食品化学分析的突出特点。在过去10年里,样品制备领域比历史上任何时候都活跃。我们已看到在这领域中相当大的进展,特别是引入适合来自不同基质的分析物的具有高亲和力和/或选择性的吸着剂的固相萃取系列。然而,需要更快、更通用的萃取方法的要求仍在上升。一些较新的方法和老方法同样的基本原理,但快速、易于操作、有机溶剂消耗较少。它们大多数比传统方法起始需要投入较高的费用,例如超临界流体萃取、加速溶剂萃取和自动化固相萃取等。色谱分析前,样品前处理主要包括:萃取和净化,有些分析物还需衍生
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色谱在食品安全分析中的应用化。常用的传统技术有:溶剂萃取(固液萃取和液液萃取)、液液分配和柱色谱分离以及化学衍生化技术。在此基础上,近年来,发展了一些样品前处理技术,如固相萃取、固相微萃取、超临界流体萃取、微波辅助萃取、加速溶剂萃取和免疫亲和色谱以及主要针对含脂质样品净化的凝胶渗透萃取法等。本章对传统的样品前处理技术基础知识做了阐述,并分别介绍一些食品色谱分析中样品前处理的新技术。
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第二节 传统的样品前处理技术
一、萃取
萃取的目的是将目标物从样品中转移至溶液。根据食品样品的成分、水分和脂肪含量、目标物的理化性质和在样品中的存在形式,选择不同萃取溶剂和萃取方法。萃取原则是从样品中尽可能完全地萃取出目标物,尽量少萃取出干扰测定的共萃取物。萃取率是萃取方法的一个重要参数,对于新化合物的分析方法特别要关注它的萃取率。添加样品的回收试验不能得到萃取率,只能得到添加的化合物在操作过程中损失的百分率。使用传统的溶剂萃取技术如固液萃取和液液萃取至今仍是很普遍的。这些技术经过时间考验,而且分析者熟悉这些方法和操作。然而,它们费时费力,通常需要大量的有机溶剂。
1食品样品常用萃取方法
食品样品溶剂萃取的固液萃取模式如下:
① 组织捣碎 这是最常用的方法。通常将样品切成小块,置于组织捣碎器中,加入适量溶剂,快速捣碎制成匀浆,过滤。为萃取充分,滤渣加溶剂再重复萃取,合并萃取液。
② 振荡萃取 这也是最常用的方法。对均匀的样品,直接加入溶剂,浸泡后在振荡器上振荡。对非均匀样品,可将样品切成小块置于组织捣碎器中,视食品样品含水量多少,加入适量蒸馏水,快速捣碎制成匀浆。称取一定量匀浆,加入溶剂,通常振荡30min~1h。振荡后过滤,残渣以溶剂洗涤,合并为萃取液。③ 索氏萃取器萃取 索氏萃取法系样品通过连续循环回流萃取,萃取效
率高,为一种经典萃取方法。萃取效果较好,但萃取时间较长。在建立新方法时,常用这种萃取方法作为对照方法。
④ 超声波萃取 样品加溶剂进行超声波萃取是一个有效的萃取方法。超
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第二章 样品前处理技术
声波搅拌使固液更密切接触,而产生的和缓地加热有助于萃取过程。将细微状态样品置于瓶中,加入溶剂,将瓶浸于超声波浴中受到超声波辐射,以超声波加速分析物的溶解和扩散,提高萃取效率。
⑤ 漂洗 用溶剂漂洗样品表面存在的分析物。这种方法萃取出的杂质少,不需要繁杂的净化步骤,但应用范围极为有限。
⑥ 对含水分较高的食品样品,如蔬菜、水果等,可用与水相溶的溶剂萃取后过滤,加硫酸钠溶液,再转移至有机溶剂中。再者,也可在萃取前加入无水硫酸钠研磨脱水,再以有机溶剂萃取。
2对溶剂要求
① 在色谱分析时,制备样品萃取液所用溶剂应以无干扰目标物色谱峰杂质为原则。
② 溶剂选择要符合相似相溶原理。如以农药残留分析为例,有机氯农药属极性小的化合物,采用非极性的溶剂,如己烷、环己烷、石油醚等;有机磷农药极性较强,因而采用极性较强溶剂,如二氯甲烷、丙酮等。
③ 溶剂的沸点太低,容易挥发,影响定容体积;溶剂沸点太高,不易浓缩,对热稳定性差的化合物更为不利。
二、液液分配
液液分配是溶剂萃取最普通的形式,也是常用的净化方法。基本原理是分析物与干扰物在两种不相溶的溶剂中分配系数不同,分析物从干扰物中分离,从而达到样品液的净化。此方法简单、快速,适用于所有类型的基质和范围广泛(由极性到非极性)的分析物。尽管其简单、快速、可以高度选择性地分离,但是有时需要使用有毒的和可燃的溶剂,且又易形成乳化,将分析物包裹和吸附在玻璃表面而引起损失。大多数情况下,一个液体是含水溶剂,另一个是有机溶剂。萃取过程的选择性和效力受溶剂对的选择所控制。在含水和有机溶剂对中,亲水的化合物进入水相,而疏水的化合物在有机相。通常更愿意将分析物分离到有机相,因为可以将有机溶剂蒸发以浓缩分析物。若最后用反相色谱分析,分析物也可分离在含水相中,因为这个相能直接进样到反相色谱柱。
1溶剂的选择
① 与水互溶的有机溶剂如低分子量的醇、酮、醛和乙腈不适合用于液液萃取。与水不互溶的有机溶剂是适合的,其应有足够的挥发性、与检测系统相适应,具有极性和形成氢键的性质,能促进分析物分配进入有机相。在这些条件之下,极性通常是选择萃取溶剂的最重要的因素。溶剂极性越接近分析物极性,萃取效率越高。
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色谱在食品安全分析中的应用② 以有机溶剂萃取食品样品中的分析物时,同时会将样品中的脂肪、蜡质和色素等萃取出来,因此应将样品液中分析物与上述共萃取物分离,才能进行分析物的测定。通常用非极性溶剂和极性溶剂组成一对溶剂来进行分配。常用溶剂对有丙酮己烷(石油醚)、乙腈己烷(石油醚)、二甲基甲酰胺己烷(石油醚)和二甲基亚砜己烷(石油醚)等。根据分析物疏水性的相对强弱来选择极性适当的溶剂,既保证分析物充分被萃取进入有机溶剂相,又具有很好的选择性。
2样品与溶剂的体积比、混合的强度和时间
除极性外,样品/溶剂体积比、混合的强度和时间也决定着萃取效率。充分混合可产生极大的界面面积确保两相完全接触,有助于质量转移。由于剧烈地混合,在液液萃取中常常可能形成乳化,特别是在样品含有表面活性剂或脂质基质时,使用大量萃取溶剂或不要剧烈混合。破坏乳化的方法有离心盐到水相,加入少量不同的有机溶剂,通过玻璃棉或滤纸过滤。液液分配这一步要注意避免出现乳化现象。一旦乳化层形成,采用离心或超声波振荡有时也难于将其破坏。若在此步骤易于出现乳化,则在溶剂混合振摇时,采用轻缓地向一个方向振摇,可避免乳化现象。
3样品/溶剂体系的pH 值
样品/溶剂体系的pH 值也是有效萃取的最重要因素之一。未离解的分析物分子溶在非极性溶剂中。在萃取前,将样品碱化使它的电离受到抑制,有助
于将碱性分析物分配到与水不相溶的有机溶剂中。要得到一个有效的液液分配净化,萃取出的碱性分析物可反萃取到酸性水溶液中。此酸性水溶液再碱化后又有助于将分析物萃取到有机溶剂中。酸性分析物同样可利用它们pK 值的特点和分配特性来萃取。然而,分析物偶尔可能会在其不稳定的pH 值范围内进行有效的萃取。为了克服这个问题,可用合适的试剂将样品中的分析物形成
能被定量萃取的衍生物,再进一步萃取。两性分析物有一个适宜的pH 值,要事先准确地测定出来,但是中性分析物与pH 值无关。在兽药分析中,有时在任何pH 值都难于从动物性食品样品中萃取出高度极性的分析物。可能的解决办法是加入硫酸钠盐析直至样品的水相消失,或采用冷冻干燥技术。冷冻干燥后,产生的固体残渣用适合的有机溶剂萃取。另一个可能的解决办法是用乙腈
使样品脱蛋白作用,再加硫酸铵直至分出乙腈相。
4离子对技术
应用离子对技术极大地改进了萃取效率。在这些技术中,直接加入特殊的子以使要转移的具有相反电荷的离子分析物以中性、很容易萃取的复合物形式从含水匀浆进入有机溶剂。然而,许多荷电相似的共存化合物能同时被萃取出。萃取的范围主要受离子对试剂的性质和浓度控制。溶剂的极性也影响离子
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第二章 样品前处理技术
对萃取能力,在许多例子中,接受氢或给出氢的性质是重要的。一例有效的离子对萃取是用四戊基铵阳离子处理一些皮质甾类葡萄糖醛酸偶合物;生成的离子对有相当的脂溶性,迅速为氯仿所萃取。
5溶剂蒸发过程
液液分配所用的有机溶剂易于挥发,浓缩或蒸干后,再将其溶于小体积溶剂中,可提高溶液中分析物浓度。然而,蒸发过程要特别小心,如果萃取物中存在酸或碱,在溶剂近干时可降解酸或碱不稳定的分析物,因而应加入少量的不干扰分析的溶剂,以避免在浓缩至干时分析物遭受损失。
三、蒸馏和浓缩
1蒸馏
蒸馏或水蒸气蒸馏适用于食品样品中挥发性物质。自食品样品中采集香气和香味成分时,利用水蒸气蒸馏。在蒸馏过程中产生的挥发性物质被吸附剂所吸附,用加热或溶剂脱附后,即可进行色谱分析。
2浓缩
从食品样品中萃取的分析物,其浓度在定量限之上,在色谱分析时无干扰,则可直接进行测定。通常样品液需要净化,且在净化和测定前,还需要将萃取液浓缩。样品液浓缩过程即溶剂挥发过程。视分析物的理化性质选择浓缩方法和条件,特别是蒸汽压高、稳定性差的分析物更要注意。浓缩过程中由于溶剂蒸干会导致分析物损失,净化后的溶液更应小心,溶液中共萃取物如脂质类杂质已被除去,为避免将溶剂蒸干,可加入少量的不干扰分析的溶剂如乙二醇等。浓缩过程易于造成分析物的损失,因而建立方法时,应进行浓缩步骤的回收试验,以考察分析物在浓缩过程的适宜条件。通用的浓缩方法如下:
① 自然挥发或在氮气流下将溶剂挥发,适用于小体积样品液和易挥发溶剂。为了加快溶剂挥发,可适当加热。商品化的N蒸发器具有恒温装置。
② 减压旋转蒸发已有各种规格的商品可选用。此法优点是温度低,浓缩速度快。
四、吸附柱色谱
吸附柱色谱法是应用最普遍的传统净化方法之一。其原理系将萃取液中的目标物与共萃取物一起经过吸附柱,使它们吸附在吸附柱上。再用适当极性溶剂洗脱,以达到目标物与杂质分离的目的。分析结果的重现性受所使用的材料和其他一些外部因素影响,如吸附剂的质量、数量、粒径和活性,混合洗脱液的极性和成分,目标物和共萃取物的物化性质,柱的填充情况等。大多数吸附柱用低极性混合溶剂洗脱时,能达到良好的净化效果。洗脱出极性较低的残留
物,极性较高的共萃取物留在柱上。洗脱液极性越高,洗脱出的干扰物质越多,净化效果越差。随样品进入柱中的高极性溶剂能立即使吸附剂减活,可改变一些化合物的洗脱轮廓。因此,在一个方法中所用的溶剂种类和数量,在未经足够核实是否能得到同样的结果时,不应随便改变。常用的吸附剂有如下几种。
1硅镁吸附剂/弗罗里矽土
① 弗罗里矽土(Florisil)是食品分析中常用的一种吸附剂。主要由硫酸镁和硅酸钠作用,形成沉淀,经过过滤,在适当条件下干燥而成。此吸附剂要在650℃加热活化1~3h。处理后储放于干燥器中。通常在使用前在130℃加热活化。20世纪70年代初,市场上难于购买到弗罗里矽土。作者所在的课题组自行合成了与弗罗里矽土性能相当的吸附剂,命名为硅镁吸附剂,当即投入生产成为商品[2]。
② 活化温度与吸附力关系。硅酸镁分子中MgO∶SiO2=1∶1,其月桂酸(LA)值较低,一般在30mg左右,不能作为吸附剂。吸附剂的活性关系到目标物与杂质分离效果,其活性以LA 值表示。弗罗里矽土的活化条件为650℃,1~3h。而作者所在的课题组试验结果表明,在制备过程中活化温度过高会降低活性(见表21)。根据试验结果,我们采用200℃进行干燥和活
化,LA值(mg/g)一般都介于100~120mg/g之间。我们也曾对三批弗罗里矽土进行了LA 值测定,测定前均经过130℃、5h加热活化,结果分别为71mg/g、80mg/g和98mg/g。
的减活程度。例如分析食品中有机氯农药残留量,需将硅镁吸附剂加水减低活性。将吸附剂置于含饱和食盐蔗糖溶液的恒湿器中,在室温或37℃放置,使吸附剂较均匀地吸收水分。试验表明,吸附剂含水小于3%吸附力大,农药不易洗脱下来;大于3%则脂肪随洗脱液流出,干扰色谱分析[3]。
2氧化铝
在分析脂类食品时,氧化铝可替代弗罗里矽土。经验表明,氧化铝能除去萃取液中某些特殊的植物共萃取物,但未被推荐用于植物样品的净化。如在农药分析中,碱性氧化铝迅速分解某些有机磷酸酯,某些极性较强的农药不能或部分的从中性或酸性氧化铝中回收。为了达到最大的效率,应小心仔细地考虑与要分析的样品和目标物都有关的最佳条件。
3硅胶
硅胶作为净化用的吸附剂效果不如氧化铝,但它在样品分析中有其重要作用。它能根据某些目标物的极性进行分离而没有什么损失。也可将硅胶做成制备薄层色谱,待各目标物分离后,用特制的小柱将分离后的目标物斑点抽吸入小柱,再用适合溶剂洗脱,得到十分纯净的溶液以进一步定性、定量分析。王绪卿等曾用此手段结合GCFPD和GCMS分析,获得和确证了杀虫双7个代谢产物[4]。
4活性炭
活性炭对植物色素有较强的吸附作用,同时对样品中目标物也会吸附,且有时不易洗脱,而影响目标物的回收。其效率受活性炭种类、预处理方法和用量影响。因此,使用活性炭脱色,要严格控制操作条件。粉状活性炭柱流动性差,要掺入硅藻土或与其他吸附剂混合,制成混合柱使用。
五、其他净化技术
1硫酸处理法
此法操作极为简便,但仅适用于对浓硫酸稳定的目标物。其原理系利用样品液中脂肪、蜡质和一些色素与硫酸作用,形成极性大的物质,从而与目标物分离。20世纪70年代初,作者所在的课题组利用硫酸处理净化食品样品,建立了各类食品中六六六、滴滴涕残留量分析方法,并已作为国家推荐标准使用至今[5~7]。
2低温冷冻法
其原理系利用样品液中脂肪和蜡质在-70℃低温下的丙酮溶液中沉淀析出。沉淀经过滤,溶液中保留目标物,达到分离净化效果。
3顶空法和蒸馏(蒸汽蒸馏)
用途有限,仅适用于挥发性物质如香料成分、熏蒸剂等。