省部重点实验室
第2楼2012/04/29
5. 设置marker
跑电泳时都要跑个marker的。这个marker实际上就是测量分子量的参照。软件可以利用这个参照来测量各条带的分子量。这个操作会罗索一点。需要作的是:
a. 指定marker泳道。一般会默认第一泳道是marker。但实际跑电泳的时候,把marker放到别的泳道上也许更好。原则是让各样品泳道尽量与marker泳道靠得近点。从这个角度来说,marker放在中间泳道比放在边上更好。
b. 指定marker的分子量序列,就是把marker各条带的分子量一个个输入到程序里。
c. 把marker分子量数值与marker泳道上的条带一一对应起来。
0
省部重点实验室
第3楼2012/04/29
6. 看结果。
这也算是一个操作步骤?算。作好了上面的选择之后,结果就自动计算出来了。但是一个图片的测量数据太多了,以至于很多人看着结果表单不知所措,哪个数据才需要的呢?见过一款软件真的很BT,能显示好几页没用的测量数据。想找到需要的数据挺费事的。
第一个要看的就是各条带的数据在哪个位置。一般的结果表单会把每个泳道的数据排成一列显示,如果要看第三泳道的第二个条带的数据,就在表单的第三列第二行上找数据。
第二个要看的是分子量数据,在表单上会标注为molecular weight 或者M.W.。实际测到的分子量数值不会是完全相同的。一般只要相差不超过3%,就可以认为其属于相同分子量。
第三个要看的是条带的光密度值。这个最罗索。会有一大堆各种各样的数据来迷惑你,让你不知道哪个才是。其实只有一个数据是有用的:IOD。有的软件上用I-vol来表示。其他的统统不必管它。
0
省部重点实验室
第4楼2012/04/29
光密度值是一个相对值,原则上,只有同一张电泳图片上的分子量相同的条带之间才能进行比较。但是分子量不同的条带之间也勉强可以作一个量的比较。
测量到了各条带的分子量与光密度,剩下的就不是图像分析的事情了。自己把数据抄到excel里去作柱状图。或者作统计计算。
大家可能注意到我没提光密度校正。是的,不是没作,而是程序已经自动作了。在你选择条带的时候,程序会自动选择相应的光密度较正方式。所以我们就不需要操心这个了。需要注意的是,所有的电泳图片能分成两类,一类是黑色背景,亮条带。另一类是白色背景,暗条带。一般程序会自动识别这两种类型,自动作好光密度校正。不过有时候图片不典型,也会让程序糊涂起来。程序弄错的时候,会表现在line profile上,你会发现上面的峰颠倒过来了。这时候就得找相应的设置。一个是指定一下分析任务,在DNA与protein之间正确地选择一个。另一个是在条带选择窗口里找“bright background, dark band”及“dark background, bright band”,在这两者之间选择一个正确的。
我这里使用的是gel-pro程序的界面以及UVP的凝胶成像系统。本讲座的重点并不在于具体如何操作软件,而是讲解为什么要作这的操作。关于这个软件的操作另有详细的操作演示。其他的设备及软件使用方法在原理上是一样的。操作方法就得自己去学了。
图片:选错了条带亮暗的类型后,line profile曲线上的峰倒过来了。
0