Pyrosequencing技术及其在DNA测序和SNP研究中的应用

省部重点实验室

2012/03/03

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电泳仪

DNA 序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一，而双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)是目前使用最普遍的DNA 序列分析技术。在基于Sanger法的全自动DNA 测序技术中，测序反应产生的DNA 片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测。Sanger法的优势在于可以分析未知DNA 的序列，且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到1000bp以上。

在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA 片段进行序列验证，而这种分析往往测几十bp就可以满足需要.在这种情况下，Sanger法未必是最合适的ＤＮＡ序列分析技术。新发展的Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术应该是目前最适合这些应用的ＤＮＡ序列分析技术。

Pyrosequencing技术是新一代DNA 序列分析技术，该技术对DNA 的序列分析无须进行电泳，DNA 片段无须荧光标记，因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置.本文将就Pyrosequencing技术的原理和应用进行介绍和讨论．

一、Pyrosequencing技术的原理

首先通过PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记的。PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育，DNA双链经碱变性分开；纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物结合成杂交体。

Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应，四种酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5´ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。

测序反应是这样进行的：在每一轮测序反应中，只能加入四种dNTP（dATP S，dTTP，dCTP，dGTP）之一，如该dNTP与模扳配对，聚合酶就可以催化该dNTP掺入到引物链中并释放焦磷酸基团（PPi）。掺入的dNTP和释放的焦磷酸是等摩尔数目的.注意：反应时deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATP S)是dATP的替代物，因为DNA聚合酶对dATP S的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATP S不是荧光素酶的底物。

硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，ATP和焦磷酸的摩尔数目是一致的。ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素(oxyluciferin)的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测并由pyrogram™反应为峰。每个峰的高度(光信号)与反应中掺入的核苷酸数目成正比。ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。然后就可以加入下一种dNTP。 Pyrosequencing技术的原理：随着以上过程的循环进行，互补DNA链合成，DNA序列由Pyrogram的信号峰确定。

商品化的Pyrosequncing试剂盒通过以下几点来保证反应的有效进行:底物浓度已最佳化，高质量的三磷酸腺苷双磷酸酶保证了所有的dNTP被降解，包括ATP和dATPαS；dNTP降解速率慢于掺入速率，有利于dNTP充分掺入；ATP合成速率快于ATP水解速率，使的ATP浓度和光产生正比于掺入的dNTP数目。

有必要指出的是:Pyrosequencing技术可以确定一个模板的20-30bp的序列。有的研究者经过改进而使该技术的读序长度增加一倍以上。

为了增加信噪比，在Pyrosequencing技术中，用dATPαS取代dATP，因为dATPαS可以比dATP被DNA聚合酶更有效利用，也更有利于阅读富含T的区域，且dATPαS不是荧光素酶的底物。但dATPαS是两种异构体SpdATPαS和RpdATPαS的混合物，聚合酶只能利用SpdATPαS。因此，为了得到最佳反应效率，必需使反应体系中保持最佳浓度的SpdATPαS，但同时增加了相应浓度的无用的RpdATPαS。dATPαS被双磷酸酶降解后的产物是双磷酸酶的抑制剂，所以随着反应进行，被双磷酸酶降解的dATPαS的降解产物浓度越来越大，双磷酸酶的活性越来越低。这可能是Pyrosequencing技术测序长度很短（20-30bp）的主要原因之一。新的革新就在于在反应体系中只加入SpdATPαS，这样一来可以大大降低dATPαS降解产物的浓度，维持双磷酸酶较长时间的活性。目前这个革新可以使Pyrosequencing技术的测序长度增加最少一倍，达到50至上百bp。

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第1楼2012/03/03

二、Pyrosequencing技术在DNA测序和SNP研究中的应用

Pyrosequencing是新一代DNA序列分析技术，因此该技术的第一个应用是DNA序列分析，基于该技术的分析系统配合相应软件还可以进行基于DNA序列分析的已知SNP的分析和SNP频率确定。

Pyrosequencing技术对DNA片段的序列分析的读序长度有限，但这并不影响其在生命科学研究中的价值.我们知道，在很多场合中，我们对DNA序列分析的要求是读序越长越好，比如诸如人类基因组计划的工作，而在很多场合中，读序长度并不是主要指标，读序精确和能说明问题是主要指标，比如分子临床诊断领域，对细菌和其他病原微生物的分子诊断，只需对最能代表该微生物的DNA片段进行分析即可，最能代表该微生物的DNA片段往往也就十几到几十bp。可以提供序列资料的分子诊断是分子诊断的黄金标准，其权威性比其他DNA分析方法如NORTHERN，基因芯片和定量RT-PCR技术更好。

SNP研究大致分为两个部分，一是SNP数据库的建立，二是SNP功能的研究。一种生物的所有SNP的数据库的建立是一件很大的工程，可以承担该工作的是那些具有大规模基因组测序能力的研究单位，而且数据库的建立很大程度上依赖Sanger法测序。但众所周知，如果不研究每个SNP的功能，数据库的建立即SNP的发现就没有多大意义。对已发现的SNP的功能的研究，有两个工作是必须的，一是SNP频率分析，一是SNP位点的碱基种类的证实.对于前者，Pyrosequencing是这样进行的:假设研究者手中有若干份来自不同个体的基因组DNA样品，要测这些不同样品的同一SNP的频率，那么研究者可以混合这些样本的基因组DNA，然后做一次PCR，进行一次测序，研究者就可以得到该SNP在这些样本中的频率.如果研究者已经有了各个样本的PCR产物，也可以将PCR产物混合后进行一次PYRO，就可以知道该SNP频率.已有的文献已经做过高达1126样本的PCR产物的混合来确定SNP的频率[2]。这种做法极大地减少了研究者的实验次数和实验消耗。一些其他研究也利用Pyrosequencing技术来确定SNP频率[3，4]。如果是SNP位点的碱基种类的证实，需要首先得到特定SNP所在DNA片段，即PCR产物，然后在SNP位点的上游和/或下游设计测序引物，这样通过对十几个bp序列测定来确定SNP位点的碱基种类及SNP位点上下游十几个碱基的序列.诸如四倍体马铃薯的一些SNP分析[5]和用于法医研究的线粒体DNA SNP分析[6]也是利用Pyrosequencing技术进行的。

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第2楼2012/03/03

纳米尺度的DNA测序可能加速个体化医疗革命

2010-08-23 09:37 来源：丁香园点击次数： 418 关键词：纳米 DNA测序生物学核苷酸

本文由丁香园站友Docofsoul 于2010-8-23转载并编译，点击此处了解原文

《每日科学》2010年8月21日报道 —— 由华盛顿大学的一名物理学家所率领的一个研究小组设计了一种方法，可在极小尺度上对DNA进行测序，并且测序速度更快、相对更加便宜。他们的实验表明，这一方法具有对卫生保健产生广泛影响的潜力。

本示意图描述了单链DNA穿越用以测序的纳米孔（图片来源：华盛顿大学）
这一成果将为更有效的个体化医学，比如说为特定症状与疾病（如肿瘤、糖尿病或毒瘾）提供遗传倾向蓝图。华盛顿大学物理学教授Jens Gundlach以第一作者身份在8月16号的《美国国家科学院院刊》上发表了一篇论文来描述这项新的技术，他说： “希望在于：10年内大家可让自己的全部DNA都得到测序，并且个体化、预防性药品也将由此诞生。” 通过结合生物学与纳米技术并利用取之于耻垢分枝杆菌porin A（Mycobacterium smegmatis porin A.）的纳米孔，研究者以该论文所介绍的技术创建一个DNA电子阅读器。该阅读器上纳米孔有个十亿分之一米尺度的开口，刚好能让单链DNA通过以便测量。研究小组的科学们将该小孔放置于浸润于氯化钾溶液的一块膜上，然后加上小电压以产生流过该纳米孔的离子流。该离子流的电签名（electrical signature）会根据穿越该纳米孔的核苷酸发生变化。核苷酸是DNA的基本组成部分（DNA含四种脱氧核苷酸：胞核嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤与胸腺嘧啶），每种核苷酸产生一个与众不同的签名。该研究小组必须解决两个主要难题：其一是建立短而狭窄的开口，刚好让DNA单链通过纳米孔，并且任何时间都只让单个DNA分子容身于该开口。阿拉巴马大学伯明翰分校的Michael Niederweis负责改造耻垢分枝杆菌以产生合适的小孔。 Gundlach指出，第二个难题则是流过该纳米孔的核苷酸的速度必须是百万分之一秒内通过一个核苷酸，这样就太快了，无法检测来自每个DNA分子的信号。为了弥补这一点，研究者将位于想测量的每个核苷酸之间的双链DNA的一部分固定，第二条链会在短暂的时间内抓住纳米孔的边缘，使DNA流停留时间足够长，让单个核苷酸停在纳米孔DNA阅读器上。在几个毫秒后，双链部分会分开，于是DNA流继续流动直到下一个双链来到，这样下一个核苷酸的测量又开始了。 Gundlach说该延迟虽然在测量时间上只有一秒的千分之几，却足够让阅读器读出来自目标核苷酸上的电信号。他说：“我们实际上能够从示波器描迹上直接读出DNA序列。” 除了Gundlach 与 Niederweiss，其他作者是华盛顿大学的Ian Derrington、Tom Butler、Elizabeth Manrao 、Marcus Collins 与阿拉巴马大学伯明翰分校的Mikhail Pavlenok。作为一项建立相关技术以求在1000美元之内的成本对人类基因组进行测序的计划的一倍分，本研究工作得到国立卫生研究院及其附属单位国立人类基因组研究研究院的资金支持。该计划始于2004年，当时耗资一千万美元对人类全基因组进行了测序。本项新的研究是向1000美元之内成本对DNA进行测序的目标迈出的重大一步。 Gundlach说：“我们的实验显示了一种新的、从根本上说非常简单的测序技术。我们希望，该技术现在能够拓展为一个机械化过程。”