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生物发光技术在细胞学检测中的应用

  • 省部重点实验室
    2012/05/06
  • 私聊

化学发光

  • 生物发光技术在细胞学检测中的应用

    摘要:本文就生物发光技术的种类、机理、及其技术特点进行了综述,并就其在细胞学检测中的应用与研究进展展开了讨论。

    关键词:生物发光; ATP;荧光素酶;细胞凋亡;细胞内游离Ca2+

    自从20多年前,Marlene A DeLuca’s第一个成功的获得表达萤火虫荧光素酶基因(luc基因)的转基因烟草以来,生物发光(Bioluminescenc,BL)作为一个古老而又年轻的技术, 近年来得到了很大的发展和广泛的应用[1, 2]。而近几年来,随着分子生物学的进展以及一些新生物技术工具的出现,尤其在某些关键技术如生物传感器、基因序列分析、活体细胞ATP 测定]等方面取得了一些突破,使生物发光的应用进入了一个新时代,极大提高了生物发光的检测和快速应用,其应用范围更进一步扩大[1]。
    1 生物发光的种类和特点
    尽管自然界中的生物体普遍存在发光现象,它们的发光机理、强度和光谱范围存在着很大差异。目前,国际上根据发光的机理不同将生物发光分为:受激荧光,发光生物发光,化学发光和生物的超微弱发光[3,4]。
    1.1 受激荧光
    受激荧光是指生物体在受到外界光辐射的作用时,体内固有的荧光物质或吸收的荧光标记物发光的现象。在生物学领域中,由于分析物质荧光的方法敏感性极高,而且几乎所有的有机分子都能够直接或经过适当的化学处理后发生荧光,故很早就受到重视,并逐渐发展成为生物学和医学中的荧光分析。在生物医学领域应用荧光分析最多的是荧光显微技术,基本工具为荧光显微镜。但一般的荧光显微镜某些情况下荧光的亮度不足,使观察困难随着光电技术和计算机技术的进步,已经发展出的激光共聚焦显微镜,操作更加方便,实验可重复性提高,使受激荧光的应用更加广泛[5]。
    1.2 发光生物发光
    在生物发光领域中最容易被人们所接受的发光现象就是以萤火虫的闪光为代表的发光生物发光[3]。现在,已了解各种发光生物发光的基本反应,在这个领域中也取得了一些新的进展,例如在体外重组虫荧光素酶,用基因工程技术在大肠杆菌中表达;人工合成荧光素;体外模拟细菌发光体系已获成功;细菌的发光基因已被提出,同样也已用基因工程方法在大肠杆菌中表达。水母发光蛋白已经分离纯化,一级结构已经清楚。由于生物发光的量子效率极高,所以研究生物发光能量的转化具有重要的理论与实际意义。近年来被广泛应用的发光蛋白,如GFP、YFP、CFP 等,其发光原理就是源自动物的自发发光,从而为生物医学研究提供了新的手段[6]。
    1.3 化学发光
    化学发光是在化学反应过程中(主要为氧化还原反应)发出可见光的现象[6]。化学发光反应是由两个关键步骤组成:激发和发射。许多化学反应进行时能释放足够的自由能而把参加反应的物质之一激发到能发射光的电子激发态,生成一种激发态产物,在它回到基态时,剩余能量转变成光子能量产生发光现象。随着化学发光物质合成技术的进步,化学发光在生物医学及其它领域的应用越来越广泛[7,8],将化学发光与免疫反应结合起来建立的化学发光免疫测定法和化学发光标记是继荧光标记,放射性核素标记,酶标记三大标记技术之后,发展起来的最新检测技术[8]。
    1.4 生物超微弱发光
    随着生物发光研究的进一步深入,发现人体的器官、组织、细胞、乃至大分子都在发光,不过发光强度更弱。这些有关生物超微弱发光(ultra-weak bioluminescence)的研究课题,构成了当前生命科学发展前沿中的一个极其重要的研究领域——生命系统的超微弱光子辐射(ultra-weak photon emission from living system) [8]。20世纪60~70 年代以来,各国先后出现了一些研究小组专门进行这方面的探讨,如日本的稻场文男小组(1991)研究了鼠肝核的超微弱天然光子发射;德国F.A. Popp小组提出了“生物光子”概念和一系列的相干理论[9]。目前研究已涉及到细胞、亚细胞乃至生物大分子的层次[ 9,10]。越来越多的实验表明,DNA 是生物超微弱发光的一个辐射源。
    1.5 生物发光特点
    研究发现生物发光有以下几个特点:
    ① 生物发光的颜色范围很宽,可从红光到深蓝光;
    ② 氧是几乎所有生物发光系统中必须的因素;
    ③ 生物发光是由“荧光素酶”与“荧光素”的化学反应所引起的;
    ④ 所有的生物发光反应似乎都是酶-底物类型的反应,但复杂程度不同,某些生物发光反应涉及3 种或4种底物,而另一些生物发光反应甚至需要3个或4个酶的体系[8]。
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  • 省部重点实验室

    第1楼2012/05/06

    2 生物发光在细胞生物学检测中的应用
    2.1 ATP生物荧光检测
    ATP(三磷酸腺苷) 是体内最重要的能量来源,起着生物系统能量交换的中心作用,,在维持生物体的正常机能上有着无可替代的作用。所有活细胞都含有ATP分子,不管其生长过程和培养条件如何,它的含量大致是一定的,迅速而准确地测定细胞内,对于研究细胞乃至机体的生理活性和代谢过程都有非常重要的意义。
    ATP生物荧光检测是基于荧火虫发光机理所设计,荧火虫发光细胞内具有特殊的发光物质-荧光素及荧光素酶,荧光素易被氧化,它在荧光素酶催化下,由ATP激活,使之与氧结合,荧光素分子中的电子跃迁到高能级,处于不稳定的激发态,当电子跳回到低能级时,即发出荧光光子。由于ATP能不断提供能量,因而荧光素分子不断地被激活,即可连续地发出荧光,其荧光强度与ATP浓度在一定范围内成线性关系,通过用发光光度计,可以检测出待测液中ATP含量[1]。该法灵敏度极高,可检测出10μl样品中的10-13g ATP含量。
    ATP生物荧光检测主要应用于样品中的活细胞数或者检测细胞的增殖。近年来,在该领域内的应用研究又有一些进展。邓晓红等建立测定PC12细胞内微量ATP含量的可行性方法及短暂缺氧血清剥夺再灌注后ATP含量的动态变化模型[12];郝巧玲(2005)等利用荧光素-荧光素酶反应系统,建立了检测细胞内ATP含量的快速生物发光方法[13],大大提高检测速度和效率。
    2.2 细胞凋亡生物发光检测
    近年来,生物发光技术广泛应用于细胞凋亡的研究。一般是采用在报告基因研究中应用的萤火虫荧光素酶(firefly luciferase),以监测肿瘤细胞的生长和治疗疗效。Mandl 等应用这一技术研究了经化疗诱导后肿瘤细胞的凋亡,荧光素酶基因转染的BCL-1 淋巴瘤荷瘤小鼠Micro-SPECT 显像发现,阿霉素治疗后3h,肿瘤对99TC-Hynic-Annexin V 的摄取明显增加,5h 达到高峰。通过生物发光 技术发现,治疗后9h,肿瘤细胞开始减少[14]。因此,应用荧光素酶报告基因的研究方法,可以对放化疗后肿瘤细胞的减少进行监测。另外,Dumon 等成功地将强荧光探针Annexin V-Oregon Green用于小鼠心肌细胞的凋亡,实现了单细胞水平实时探测[15]。
    最近,一种近红外荧光染料Cyanine-5.5( Cy 5.5)被连接于Annexin V,用于探测细胞凋亡。接种MCA-29 的荷瘤裸鼠经电离辐射后,对Cy 5.5的摄取显著增加[16]。更令人关注的是,由于这种荧光染料的稳定性很高,允许在10天内反复探测,以监测细胞凋亡,这或许可以弥补放射性核素标记物自身衰变的缺点。这种方法最大的优势在于能够实时监测细胞凋亡,因为其信号不需要作任何处理就可直接观察。实时探测细胞凋亡对于研究运动器官(如心脏)的凋亡特别有价值,另外,对于肿瘤放化疗的疗效监测以及随后的治疗方案决也很有帮助。Cy 5.5-Annexin V有望成为一种新的用于凋亡荧光成像的配体。
    2.3 利用生物发光蛋白测定细胞内游离Ca2+
    钙是人体内极其重要的金属元素,广泛分布于人体的细胞和体液之中。Ca2+除了作为组成骨骼、牙齿的主要原材料外,还参与、调控众多的生命过程。它不仅直接激活具有重要生理意义的胞内机械活动,如肌肉收缩等,而且也作为胞内第二信使介导胞外信号(如激素)对胞内的反应。Ca2+对细胞的代谢与功能的调节作用几乎涉及到细胞的所有生理和生化过程。细胞内游离Ca2+浓度及其分布的变化代表着某种细胞功能的启动、加强和抑制,是形成Ca2+信号的基础。通过观察细胞内Ca2+水平提高或抑制时相应生理应答反应的变化,有助于了解Ca2+对正常生理反应的调节过程, 实时、准确地测定胞内游离Ca2+的含量,对研究其与细胞功能的关系具有十分重要的意义[17]。
    1967年,Ridgway和Ashley用从水母(acguoreaforskalea)中分离出的一种蛋白质— 水母发光蛋白(acguorin),第一次成功地测定了活细胞内[Ca2+] 。水母蛋白与Ca2+结合后激活而发出蓝色荧光(465mm),在0.1一10μmol/L Ca2+范围内荧光强度与[Ca2+]成正相关,是目前应用最广的一种Ca2+生物发光指示剂。Ca2+生物发光指示剂不受光漂白效应的影响,对细胞无毒性,但其有以下几个不足之处,限制了其广泛应用。
    ① 高浓度Ca2+会使其不可逆转地失效;
    ② 光输出太弱,平均每6个水母蛋白分子结合至少12个Ca2+,只发射一个光子,故对于小的单细胞Ca2+的检测非常困难;
    ③ 分子量大,必须采取微注射进人细胞,且不易在胞浆中迅速扩散;
    ④ 发光高峰到达迟缓,较相应的生理过程慢,瞬间的细胞[Ca2+]变化难以检测[5];
    最近几年来,人们用基因工程方法,将光降解的水母发光蛋白基因导人动、植物细胞,并在其中表达,成功地解决了负载时人工注射的困难和对细胞的损伤问题,同时与细胞器特异靶蛋白结合导人时,还实现了细胞器、胞核内[Ca2+]的 测定。然而,由于细胞器是不均一的以及高浓度[Ca2+]不仅使光辐射增强,同时也摧毁发光蛋白,因而采用水母蛋白测定报道的内质网[Ca2+]水平目前尚有争议[18]。

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  • 省部重点实验室

    第2楼2012/05/06

    3 展望
    生物发光技术已经被证明是一种有效的、多功能的生物学分析工具,适用于多种应用。现在,在很多生物技术领域,生物发光技术已经作为一个优秀的基本检测原理得到应用,包括:报告基因技术,基因探针检测。当然,生物发光技术还可以针对各种医学、制药和环境的目标分析物进行超灵敏检测,正好与目前高通量分析仪器的小型化,生物分析等趋势相吻合。新的生物发光技术应用,例如BRET(Bioluminescence Resonance Energy Transfer,生物发光共振能量转移),基因融合,重组全细胞生物传感器等也将变得越来越普遍。
    当然,伴随着这些显著的优点,生物发光技术同样也有一些缺陷。从实践的观点来看,生物发光技术与传统的分光光度测定和荧光技术相比,更容易受基质中的成分影响(通常是淬灭)。另一个限制因素是,相比分光光度和荧光测量的仪器,生物发光技术的检测仪器,特别是需要高灵敏度检测时,所需要的仪器通常非常昂贵。
    随着新的生物技术工具的不断产生,新的生物发光报告基因的发现、克隆和测序,进而推动多重标记系统的研究,我相信生物发光技术将进一步得到发展。

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  • ericwong

    第3楼2012/05/07

    不错的资料。让大家又了解了一种发光检测的方法

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  • 省部重点实验室

    第4楼2012/05/07

    现在 生物领域 发展很快
    生命科学方面 检测前景很好啊

    ericwong(ericwong) 发表:不错的资料。让大家又了解了一种发光检测的方法

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  • ericwong

    第5楼2012/05/07

    10几年来,生物领域(尤其是生命科学)方面得到了飞速的发展,作为生物分析的手段,各种检测方法也得到蓬勃发展,各种发光检测技术既是如此

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  • 省部重点实验室

    第6楼2012/05/07

    很多检测机构 都争取在先进检测手段 仪器方面下血本的啊

    仪器跟着也有快速的发展

    ericwong(ericwong) 发表:10几年来,生物领域(尤其是生命科学)方面得到了飞速的发展,作为生物分析的手段,各种检测方法也得到蓬勃发展,各种发光检测技术既是如此

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  • ericwong

    第7楼2012/11/29

    当前生物发光技术在实际应用中好像不多

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  • BGFLASER

    第8楼2021/12/19

    需要荧光激发的光纤插针可以找我。

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