生物发光技术在细胞学检测中的应用

2 生物发光在细胞生物学检测中的应用
2.1 ATP生物荧光检测
ATP(三磷酸腺苷) 是体内最重要的能量来源，起着生物系统能量交换的中心作用，，在维持生物体的正常机能上有着无可替代的作用。所有活细胞都含有ATP分子，不管其生长过程和培养条件如何，它的含量大致是一定的，迅速而准确地测定细胞内，对于研究细胞乃至机体的生理活性和代谢过程都有非常重要的意义。
ATP生物荧光检测是基于荧火虫发光机理所设计，荧火虫发光细胞内具有特殊的发光物质-荧光素及荧光素酶，荧光素易被氧化，它在荧光素酶催化下，由ATP激活，使之与氧结合，荧光素分子中的电子跃迁到高能级，处于不稳定的激发态，当电子跳回到低能级时，即发出荧光光子。由于ATP能不断提供能量，因而荧光素分子不断地被激活，即可连续地发出荧光，其荧光强度与ATP浓度在一定范围内成线性关系，通过用发光光度计，可以检测出待测液中ATP含量[1]。该法灵敏度极高，可检测出10μl样品中的10-13g ATP含量。
ATP生物荧光检测主要应用于样品中的活细胞数或者检测细胞的增殖。近年来，在该领域内的应用研究又有一些进展。邓晓红等建立测定PC12细胞内微量ATP含量的可行性方法及短暂缺氧血清剥夺再灌注后ATP含量的动态变化模型[12]；郝巧玲（2005）等利用荧光素-荧光素酶反应系统，建立了检测细胞内ATP含量的快速生物发光方法[13]，大大提高检测速度和效率。
2.2 细胞凋亡生物发光检测
近年来，生物发光技术广泛应用于细胞凋亡的研究。一般是采用在报告基因研究中应用的萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)，以监测肿瘤细胞的生长和治疗疗效。Mandl 等应用这一技术研究了经化疗诱导后肿瘤细胞的凋亡，荧光素酶基因转染的BCL-1 淋巴瘤荷瘤小鼠Micro-SPECT 显像发现，阿霉素治疗后3h，肿瘤对99TC-Hynic-Annexin V 的摄取明显增加，5h 达到高峰。通过生物发光 技术发现，治疗后9h，肿瘤细胞开始减少[14]。因此，应用荧光素酶报告基因的研究方法，可以对放化疗后肿瘤细胞的减少进行监测。另外，Dumon 等成功地将强荧光探针Annexin V-Oregon Green用于小鼠心肌细胞的凋亡，实现了单细胞水平实时探测[15]。
最近，一种近红外荧光染料Cyanine-5.5（ Cy 5.5）被连接于Annexin V，用于探测细胞凋亡。接种MCA-29 的荷瘤裸鼠经电离辐射后，对Cy 5.5的摄取显著增加[16]。更令人关注的是，由于这种荧光染料的稳定性很高，允许在10天内反复探测，以监测细胞凋亡，这或许可以弥补放射性核素标记物自身衰变的缺点。这种方法最大的优势在于能够实时监测细胞凋亡，因为其信号不需要作任何处理就可直接观察。实时探测细胞凋亡对于研究运动器官（如心脏）的凋亡特别有价值，另外，对于肿瘤放化疗的疗效监测以及随后的治疗方案决也很有帮助。Cy 5.5-Annexin V有望成为一种新的用于凋亡荧光成像的配体。
2.3 利用生物发光蛋白测定细胞内游离Ca2+
钙是人体内极其重要的金属元素，广泛分布于人体的细胞和体液之中。Ca2+除了作为组成骨骼、牙齿的主要原材料外，还参与、调控众多的生命过程。它不仅直接激活具有重要生理意义的胞内机械活动，如肌肉收缩等，而且也作为胞内第二信使介导胞外信号(如激素)对胞内的反应。Ca2+对细胞的代谢与功能的调节作用几乎涉及到细胞的所有生理和生化过程。细胞内游离Ca2+浓度及其分布的变化代表着某种细胞功能的启动、加强和抑制，是形成Ca2+信号的基础。通过观察细胞内Ca2+水平提高或抑制时相应生理应答反应的变化，有助于了解Ca2+对正常生理反应的调节过程， 实时、准确地测定胞内游离Ca2+的含量，对研究其与细胞功能的关系具有十分重要的意义[17]。
1967年，Ridgway和Ashley用从水母(acguoreaforskalea)中分离出的一种蛋白质— 水母发光蛋白(acguorin)，第一次成功地测定了活细胞内[Ca2+] 。水母蛋白与Ca2+结合后激活而发出蓝色荧光(465mm)，在0.1一10μmol/L Ca2+范围内荧光强度与[Ca2+]成正相关，是目前应用最广的一种Ca2+生物发光指示剂。Ca2+生物发光指示剂不受光漂白效应的影响，对细胞无毒性，但其有以下几个不足之处，限制了其广泛应用。
① 高浓度Ca2+会使其不可逆转地失效；
② 光输出太弱，平均每6个水母蛋白分子结合至少12个Ca2+，只发射一个光子，故对于小的单细胞Ca2+的检测非常困难；
③ 分子量大，必须采取微注射进人细胞，且不易在胞浆中迅速扩散；
④ 发光高峰到达迟缓，较相应的生理过程慢，瞬间的细胞[Ca2+]变化难以检测[5]；
最近几年来，人们用基因工程方法，将光降解的水母发光蛋白基因导人动、植物细胞，并在其中表达，成功地解决了负载时人工注射的困难和对细胞的损伤问题，同时与细胞器特异靶蛋白结合导人时，还实现了细胞器、胞核内[Ca2+]的 测定。然而，由于细胞器是不均一的以及高浓度[Ca2+]不仅使光辐射增强，同时也摧毁发光蛋白，因而采用水母蛋白测定报道的内质网[Ca2+]水平目前尚有争议[18]。

3 展望
生物发光技术已经被证明是一种有效的、多功能的生物学分析工具，适用于多种应用。现在，在很多生物技术领域，生物发光技术已经作为一个优秀的基本检测原理得到应用，包括：报告基因技术，基因探针检测。当然，生物发光技术还可以针对各种医学、制药和环境的目标分析物进行超灵敏检测，正好与目前高通量分析仪器的小型化，生物分析等趋势相吻合。新的生物发光技术应用，例如BRET（Bioluminescence Resonance Energy Transfer，生物发光共振能量转移），基因融合，重组全细胞生物传感器等也将变得越来越普遍。
当然，伴随着这些显著的优点，生物发光技术同样也有一些缺陷。从实践的观点来看，生物发光技术与传统的分光光度测定和荧光技术相比，更容易受基质中的成分影响（通常是淬灭）。另一个限制因素是，相比分光光度和荧光测量的仪器，生物发光技术的检测仪器，特别是需要高灵敏度检测时，所需要的仪器通常非常昂贵。
随着新的生物技术工具的不断产生，新的生物发光报告基因的发现、克隆和测序，进而推动多重标记系统的研究，我相信生物发光技术将进一步得到发展。

不错的资料。让大家又了解了一种发光检测的方法

现在 生物领域 发展很快
生命科学方面 检测前景很好啊

10几年来，生物领域（尤其是生命科学）方面得到了飞速的发展，作为生物分析的手段，各种检测方法也得到蓬勃发展，各种发光检测技术既是如此

很多检测机构 都争取在先进检测手段 仪器方面下血本的啊

仪器跟着也有快速的发展

当前生物发光技术在实际应用中好像不多