省部重点实验室
第1楼2012/06/10
第二向 SDS-PAGE电泳
1. 配制 12%的丙烯酰胺凝胶。
2. 待凝胶凝固后, 倒去分离胶表面的MilliQ水、 乙醇或水饱和正丁醇,用MilliQ 水冲洗。
3. 配制胶条平衡缓冲液 I
4. 在桌上先放置干的厚滤纸,聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另 一份厚滤纸用 MilliQ水浸湿,挤去多余水分,然后直接置于胶条上,轻轻吸 干胶条上的矿物油及多余样品,这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
5. 将胶条转移至样品水化盘中,加入 6ml(17cmIPG)平衡缓冲液 I ,在水平摇床 上缓慢摇晃 15 分钟。
6. 配制胶条平衡缓冲液 II 。
7. 第一次平衡结束后,取出胶条将之竖在滤纸上沥去多余的液体,放入平衡缓 冲液 II 中,继续在水平摇床上缓慢摇晃 15 分钟。
8. 用滤纸吸去 SDS-PAGE胶上方玻璃板间多余的液体,将二向凝胶放在桌面上, 凝胶的顶部面对自己。
9. 将琼脂糖封胶液加热溶解。
10. 在 100ml 量筒中加入 TGS 电泳缓冲液。
11. 第二次平衡结束后,取出胶条,用滤纸吸去多余的平衡液(将胶条竖在滤纸 上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面) 。
12. 用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在 1×电泳缓冲液中漂洗数次。
13. 将胶条背面朝向玻璃板,轻轻放在长玻板上,加入低熔点琼脂糖封胶液。
14. 用适当厚度的胶片,轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接 触。注意:不要在胶条下方产生气泡, 应推动凝胶背面的支撑膜, 不要碰到面胶。
15. 放置 5 分钟,使低熔点琼脂糖封胶液凝固。
16. 打开二向电泳制冷仪,调温度为 15℃。
17. 将凝胶转移至电泳槽中,加入电泳缓冲液,接通电源,起始时用的低电流(5mA~10mA/gel/17cm) ,待样品在完全走出IPG 胶条,浓缩成一条线后,再加大电流 (20-30mA/gel/17cm) 待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
18. 电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,并切角以作记号(戴手套,防 止污染胶面) 。
19. 进行染色。