蛋白等电聚焦凝胶电泳技术

3.载体两性电解质的选择

载体两性电解质是一些具有相近等电点的分子量为600－900Da的多氨基多羟基两性化合物的混合物，下面时配置不同pH范围等电聚焦凝胶的载体两性电解质的配方：

5.电泳

操作步骤：

1）将蛋白样品于等体积的2×上样缓冲液混合，10000×g离心5min以除去蛋白质沉淀；2）用微量注射器将蛋白质样品加入到上样空底部，注意不要溢出来。注意：对于考马斯亮蓝染色液来说，每个泳道10-30ug的蛋白混合粗提物（我们俗称粗抗原）或者5-10ug单一蛋白组分是较合理的上样浓度。

电泳液：

1）上槽中加入阴极电泳液（20mM氢氧化钠：须由1M储存液新鲜配置）；

2）下槽中加入阳极电泳液（10mM磷酸：须由1M储存液新鲜配置）。

等电聚焦电泳条件：

1）接好电极；

2）恒压150V电泳30min；

3）恒压200V电泳2.5h，开始时候控制电流为10mA左右，在聚焦过程中电流有所下降，电泳内室温度在电泳的过程中将升至40－50摄氏度。

6．电泳聚焦后处理

测定pH梯度：

1）将凝胶条切成0.5cm或1cm的小片；

2）将每小片凝胶在1ml 10mM KCl中 浸泡30min；

3）测读此KCl溶液的pH值、

凝胶的固定：

1）将凝胶于10%三氯乙酸中浸泡10min；

2）换成1%三氯乙酸溶液继续浸泡至少2h以上，以去除载体两性电解质，浸泡过夜可以更好的降低考马斯亮蓝对载体两性电解质的染色。

凝胶的染色：用考马斯亮蓝染色，然后脱色，制成干胶。

7.天然等电聚焦电泳的修正方案

如果要进行天然等电聚焦电泳，要做一些修改；

1） 胶过程中配的凝胶中不需要加尿素；

2）上样缓冲液（2×）5ml：其中1.8ml水，200μl载体两性电解质（同制胶成分），3ml甘油，上样时候于等体积样品混匀，10000×g离心5敏即可上样；

3）室温下电泳，接好电极，恒压下先200V电泳1.5h，再400V电泳1.5h。

8.常见问题及解释

1） 若产生模糊条带则证明聚焦不完全，这可能是由于电泳中的问题或大分子蛋白质限制了其在凝胶中的迁移能力。若聚焦时间过长或过短，条带的分辨率会下降。增加电压梯度可以使带形更加锐利。高分子量蛋白质在琼脂糖凝胶中可以聚焦的更好。

2） 产生歪斜的条带通常由于不正确的pH梯度，检查电极是否洁净，是否同凝胶链接良好，同时应该注意凝胶的边缘效应。

3） 蛋白带的纹理现象是等电聚焦中经常遇到的问题，可能是一下原因：

a，蛋白质聚集或沉淀（尤其在等电点附近），或上样量过大，8M尿素通常用来防止蛋白质聚集，去垢剂Triton X－100和NP－40常用来防止膜蛋白的聚集，所以上样前一定要离心以除去不溶解的颗粒；

b，样品中残存核酸，可以采用多种方法去除核酸污染，如酸抽提、盐沉淀、核酸酶消化等；

c，蛋白质修饰，非超纯级的尿素中的异氰酸盐污染物可能导致蛋白质的氨甲酰化，预电泳可以去除异氰酸盐，蛋白质样品处理或储存不当会发生包括Cys残基氧化，Asn或Gln残基去氨基化等修饰过程；

d，波浪形条带常由于样品中盐浓度过高，有时候载体两性电解质或电极液不纯或电极不洁净也会产生波浪形条带；

e，电极同凝胶连接不平行，配置凝胶时候试剂不纯，载体两性电解质浓度过低可导致不均等的pH梯度，若凝胶碱性部分pH梯度丢失，其可能原因是阳极飘移，可以补充pH9－11的载体两性电解质或进行非平衡pH梯度电泳；

f，染色时候高背景的产生可能由于固定后载体两性电解质仍残留于凝胶中，增加1％三氯乙酸的固定时间可解决；

g，蛋白质条带丢失或过淡可能由于蛋白质分子量较低（<10kDa〉或蛋白质在固定中未被变性，增加三氯乙酸浓度或使用戊二醛固定即可；

h，复杂的蛋白质混合物等电聚焦后可以产生相互重叠的斑点，改变等电聚焦凝胶pH范围可以解决此问题。进一步的蛋白质纯化或免疫沉淀处理可以避免重叠斑点的产生。