[目的]掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准曲线的绘制。
[原理]
双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲
反应，蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。
双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。
[操作]
（一） 绘制标准曲线
（二） 未知样品蛋白质浓度的测定
1．取12支试管
6支分别加入0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0毫升的标准
6支分别加入1毫升不同稀释浓度的待测液（两两相同）。
2．分别加水补足到2毫升。
3．分别加入4毫升双缩脲试剂在室温/37℃下放置30分钟。
4．在540毫微米波长下分光光度计比色、读数，记录各管A值。 ．
[计算]
(一) 在座标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。
(二) 从标准曲线中查出待测血清样本的蛋白质浓度(g／L)，并求出人血清样本的蛋白质 浓度。
(三) 再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出人血清样本的蛋白质浓度(g／L)。
[器材]
中试管7支，l毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，水浴箱，721型分光光度计、坐标纸。
[试剂]
(—) 6N NaOH：称取240g氢氧化钠溶于1000ml水中。
(二) 双缩脲试剂：称取CuS04·5H2O 3．0克，酒石酸钾9．0 克和碘化钾5．0克，分别溶解后混匀，加6N NaOH l00ml，最后加水至1000ml，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。如有暗红色沉淀出现，即不能使用。
(三) 0.9％NaCl。
(四) 蛋白质标准液(10mg／m1)，称取干燥的牛血清蛋白100．0mg，以少量生理盐水溶解后倒入l0ml容量瓶中，淋洗称量瓶数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线，或用凯氏定氮法测定血清蛋白质含量，然后稀释成l0mg／m1作为蛋白质标准液。
(五) 待测血清样本：将人血清或动物血清用生理盐水稀释10倍后再测定。
双缩脲法测定蛋白质含量需注意哪些问题？
0.1g/mL的 NaOH 0.01g/mL CuSO4 先加 NaOH 造成碱性环境，约2mL 再加CuSO4,不能加多 3、4滴左右。太多CuSO4 的蓝色会对紫色实验结果造成影响。还有如果用蛋清，必须稀释，否则影响效果，实验后还会粘住试管壁。若用豆浆，也要稀释的清淡一些，效果才会好。~~
双缩脲法测定蛋白质含量（考核实验）
一、 教学目的与要求：
① 加强对蛋白质的有关性质的认识；
②掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法；
③对学生所学进行综合的测试。
二、 教学实验原理：
蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量氨基酸成分无关，因此利用此进行比色测定蛋白质含量。
在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540—560nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知的蛋白质浓度，标准蛋白溶液可以用结晶的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。
除-CONH-有此反应外，-CONH2-，-CH2-，NH2-，-CS-CS-NH2，等基团亦有此反应。
三、 考核主要内容
1、 标准曲线的制作
取6支干净的试管，按0→5编号，然后按下表依次加入试剂，充分混匀，在室温下放置半小时，以管为空白，在550nm波长处测定消光值（OD），以各管蛋白质含量（毫克）横坐标，OD值为坐标，画出标线。
编号
|
0
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
蛋白质标准液（毫升）
|
0
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0.2
|
0.4
|
0.6
|
0.8
|
1.0
|
蒸馏水（毫升）
|
1.0
|
0.8
|
0.6
|
0.4
|
0.2
|
0
|
双缩脲试剂（毫升）
|
4.0
|
4.0
|
4.0
|
4.0
|
4.0
|
4.0
|
2、 样品测定：取样品液1.0 ml，同法进行，测其OD值，对照标准曲线求得未知液蛋白质浓度。
3、 分光光度计的使用：规定每组在10min以内全部完成操作（共测6支管）；同时注意操作是否规范。
4、 成绩的计算：此次的实验占30%（包括平时的表现及实验报告的完成情况和完成质量），平时的五次实验共占70%，每次实验按总分为5分为满分进行打分，总评折合成百分制。
四、 实验注意事项：
① 标准样品的浓度为：10μg/ml；
② 实验过程中不得过问他人，同组人可以配合进行；
③ 实验报告在课堂上独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他人数据，一旦发现以零分处理；
④ 实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做；
⑤ 对实验结果进行简单的分析.
双缩脲法（Biuret法）测蛋白质含量
2008年10月30日14:13 阅读次数： 903 [字号：大 中 小]
（一）实验原理
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
H2O
O=C C=O
HN NH
R-CH CH-R
O=C Cu C=O
HN NH
R-CH CH-R
H2O
紫色络合物
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材
1. 试剂：
（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为 0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。
（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4•5H2O）和 6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2. 器材：
可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
（三）操作方法
1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。
2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。
改良的双缩脲法快速测定蛋白质含量
(一) 方法原理
蛋白质有两个以上的肽键, 因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu++ 形成紫红色络合物, 其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比, 而与蛋白质的分子量及基酸成分无关。显色反应受温度影响颇大, 在常温(20～25℃)下需1小时, 40℃需15分钟, 60℃需5分钟。
(二) 仪器、设备
1. 仪器 光电比色计；离心机(4000转/分)；分析天平(感量0.0001克或0.001克)；恒温振荡器或恒温水浴锅；离心管、刻度吸管。
2. 试剂 4%硫酸铜(CuSO4 ·5H2 O)溶液；2.5%酒石酸钾钠溶液；双缩脲试剂配制: 在500毫升容量瓶中, 依次加入4%CuSO4 ·5H2 O 30毫升和2.5%酒石酸钾钠100毫升, 再慢慢加入5mol/L KOH 30毫升, 最后用蒸馏水稀释至刻度。使用时,再将上述溶液与透明度良好的异丙醇混合。
(三) 测定步骤
1. 酪蛋白标准曲线制备: 称取国产酪蛋白质2克(磨细至80目)于0.15mol/L KOH溶液中, 加热溶解并定容至100毫升, 分别取此溶液0.2～0.9毫升8份, 加入10毫升双缩脲试剂, 在60℃的恒温水浴振荡器中振荡5分钟显色完全, 随后以4000转/分离心10分钟,取离心液在波长550nm下, 以1cm比色杯进行比色测定, 空白为不加酪蛋白的试剂。同时取此溶液5毫升(双样)进行凯氏定氮, 乘以换算系数6.41即为酪蛋白含量。根据测得的光密度值与相应酪蛋白含量进行回归, 算出回归方程式Y=a+bX(X为酪蛋白光密度,Y为相应酪蛋白含量克)。
2. 样品处理与测定: 样品粉碎磨细通过40目筛孔, 以风干重样品或烘干重样品测定蛋白质含量。在分析天平上准确称取待测样品0.1000克, 放入干燥的25毫升凯氏消化瓶或大试管中, 内放几粒玻璃珠, 加入10毫升双缩脲试剂, 在60℃的恒温水浴振荡器上振荡5分钟, 随后以4000转/分离心10分钟, 取离心液在波长550nm下,以1cm比色杯进行比色测定, 空白为不加样品的试剂溶液。
(四) 结果计算
将样品测得的光密度值代入酪蛋白回归方程Y=a+bX(其中X表示样品光密度值,Y代表样品蛋白质含量克)。再乘以释倍数1000,即为100克样品中蛋白质含量(克)。
(二)
附注:
(1) 对含脂肪高的样品溶液与双缩脲试剂混合后, 若有雾状沉淀,需让其静置二小时以上, 再离心, 取其清液比色。
(2) 异丙醇可降低淀粉的溶解性,有利于蛋白质提取及显色。
实验（三） 蛋白质浓度测定——双缩脲法
[原理]
将尿素加热，两分子尿素放出一分子氨而形成双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）。
双缩脲在碱性溶液中与Cu2+结合生成紫色络合物，这一呈色反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中的肽键类似双缩脲结构，故亦能呈双缩脲反应。
在一定的浓度范围内，颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系。蛋白质浓度越高，体系的颜色越深。反应产物在540nm处有最大光吸收。
将未知浓度的样品溶液与一系列已知浓度的标准蛋白质溶液同时与双缩脲试剂反应，并于540nm比色，可通过标准浓度蛋白质绘制的标准曲线，求得未知样品蛋白质的浓度。
凡含有一个肽键和一个-CSNH2、-CRHNH2、-CHNH2-CHNH2-CH2OH、-CHOH-CH2OH、-CHOH-CH2NH及乙二酰二胺等物质也有此反应。
本法操作简便，迅速，蛋白质浓度与光密度的线性关系好，是蛋白质浓度分析的常用方法之一，但本法缺点是灵敏度较低，蛋白质量须在1～20mg/ mL方有较佳结果。在需要快速，但准确性要求不高的测定中，常用此法。
[方法与步骤]
标准曲线的绘制
取6支试管从0～5编号，按下表分别加入各试剂，每加一种试液均须混匀，加毕后于室温放置30分钟，然后以0号管作为空白对照管，540nm处测定各管A值。
管号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
标准酪蛋白/mL 蒸馏水/mL 双缩脲试剂/mL | 0 1.0 4.0 | 0.2 0.8 4.0 | 0.4 0.6 4.0 | 0.6 0.4 4.0 | 0.8 0.2 4.0 | 1.0 0 4.0 |
以标准酪蛋白（mg）为横坐标，A 540值为纵坐标，绘制标准曲线。
未知浓度的样液测定
可用牛奶中提取的酪蛋白配制溶液。未知酪蛋白浓度的样品测定3管。方法步骤与上述标准曲线制作过程的5号管相同，仅用未知浓度酪蛋白溶液1.0mL代替标准酪蛋白。
标准曲线的制作与未知浓度蛋白测定过程是同时进行的。
根据未知浓度酪蛋白试液的A540值，在标准曲线上查出其对应的蛋白毫克数，即为所测酪蛋白溶液的质量浓度(mg/mL)。
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