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【极限体验】维生素D3系统适用性溶液中一个未知杂质的来源探究

  • fengmo4668
    2012/07/17
  • 私聊

厂商论坛

  • 【背景】
    上个月发了个关于维生素D3的体验(详情参见http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20120629/4119572/主题:【原创】【极限体验】记一次维生素D原料的入厂检验),基本上很是满意。

    做维生素D3的系统适用性时,药典上描述的是,经过高温和光照破坏,得到的前维生素D3峰、反式维生素D3峰,速甾醇D3峰,加上维生素D3主峰,一共为四个峰。但是我破坏后得到的却是五个峰。根据药典上得相对保留时间来核对,多了一个12.2min的峰(如下图)。



    我的推测,可能是第二次高温光照时没有充氮,产生的VD3的降解产物。

    Arvid建议我充氮保护一下,再做一次,验证会不会还出现12min的那个峰。

    雪妖版主也指出,因为没有做溶剂空白,也不能排除是溶剂高温光照产生的。

    因此,我这次就做了这个实验,来大概确认一下其来源。

    【色谱条件】

    仪器型号:Agilent 1260;检测器:DAD检测器;色谱柱:TopsilTM(拓谱)Silica Si 4.6*250mm 5μm;流动相:正己烷-正戊醇(997:3);检测波长:254nm,流速:2 ml/min

    【实验设计】

    有了上一次的实战经验,这次做的有点驾轻就熟。

    因为上次光照的时间问题,这次有意识的延长了一段时间。

    本次试验持续了两天。

    第一天,只是单纯的想搞清楚12min的峰的来源,以及未充氮的可能影响。

    但是最终结果不是很理想(结果部分有详细介绍)。因此在第二天的试验设计中,为了更好的搞清楚高温和光照以及不充氮对维生素D3各有什么样的影响,选择空白溶剂、充氮样品,未充氮样品进行对比,并把高温后未光照的样品作为一个监测点。


    【试验结果】
    第一天:
    因为流动相为两种混合溶剂,特别是正戊醇含量特别少,每次配制流动相的细微差异可能会导致主峰保留时间的移动,因此先确定主峰的保留时间。
    充氮及未充氮样品高温光照后的结果:


    可以看到,12min处几乎没有峰。难道是上次的样品被污染出现的?为什么这次又没有踪迹了呢?奇怪!
    但是,后面应该出现速甾醇的位置也没有峰。充氮和未充氮的谱图基本上没有什么差异,只是6min的地方多出一个峰,而且未充氮的更大一些。
    肯定还是哪个地方有问题。或者,光照的强度不够??因为我的紫外荧光仪是很老的设备了,灯管处的玻璃都出现锈蚀了。

    第二天:
    把昨天未倒掉的样品又经历了高温和光照的过程。检验结果见下图。

    奇怪不? 12min的峰及速甾醇都出现了,6min的峰倒快消失不见了!一头雾水啊!

    重新称样品,一步一步的重新开始做。
    基本可以判断溶剂与12min的峰没有任何关系!

    然后是样品的结果:

    果然,不管是充氮的,还是未充氮的样品,在经历了高温和光照后都出现了12min的峰。说明12min的峰是与维生素D3相关的物质!而且,只高温未光照,不管是充氮或者不充氮,均没有出现12min的物质,因此可以判定,其的出现,和光照有直接关系!

    速甾醇(主峰后的峰)在高温未光照的充氮样品中没有出现,光照后出现,证明和光照相关;在高温未光照的未充氮样品也有出现,说明和氧气也有一定的相关性;而光照后的未充氮样品中速甾醇的峰高峰面积增大,则进一步确证其和光照是相关的!

    【结论】
    1. 确认保留时间在12min的峰不是溶剂高温或光照产生的。


    2. 确认保留时间在12minVD3的相关物质,并且与光照有关。

    3. 速甾醇的产生,和氧气及光照均有关系。

    4. 12min、14min、15min、19min、25min、30min的物质都是VD3的相关物质。
    为何?
    14min为前维生素D3,15min为反式维生素D3,30min为速甾醇,这是中国药典上规定的,不必解释。19min和25min是VD3样品中(参见维生素D3的有关物质检验谱图,http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20120629/4119572/主题:【原创】【极限体验】记一次维生素D原料的入厂检验),12min也已经确认是维生素D3的光照产物。

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  • fengmo4668

    第1楼2012/07/17

    【讨论】
    1. 第一天的样品中, 6min的物质是和谁相关的呢?
    其在样品和溶剂中没有出现,但是高温光照后出现。且未充氮的样品比充氮样品的峰高要高些。
    第二天再重新高温光照样品,6min物质又几乎消失。
    难道是我的进样小瓶不干净???

    2. 12min、14min、15min、19min、25min、30min的物质都是VD3的相关物质。那为何药典上之规定了14min.15min和30min,而对12min、19min、25min视而不见,不做规定呢?
    我的推理是,因为14min与15min(与主峰的相对保留时间分别为0.5和0.6),维生素D3和30min的物质(与主峰保留时间为1.1)分别是极性最相近的物质(由色谱柱的保留时间也可以判断出),如果其两两之间分离度可以达到要求,12min、19min、25min的物质的分离度自然不在话下,肯定能满足分离度要求。也即是说,控制住以上两对物质的分离度,所有物质的分离度就都控制住了。因此药典上未对其他有关物质作规定。

    此推论理由对否?

    欢迎赐教!

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  • happy爱米粒

    第2楼2012/07/18

    fengmo实验室能做所有的维生素吗?这么晚了还在熬灯苦战,辛苦了!
    ps:系统适用性到底该如何验证呢?

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  • dahua1981

    第3楼2012/07/18

    应助达人

    风魔这段时间一直在做维生素吗

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  • fengmo4668

    第4楼2012/07/18

    药典上有专门的规定。
    就是把一个目标物A,经过一系列的破坏试验,让其产生出于目标物A相关的各物质,可能为B、C、D.......等等几个或更多个物质。

    然后试你的色谱条件。在该色谱条件下,所有物质必须达到正常分离。也就是说,各有关物质对你的目标物均不会干扰。此时,你的液相系统适用你的样品检测。

    木有才(xgy2005) 发表:fengmo实验室能做所有的维生素吗?这么晚了还在熬灯苦战,辛苦了!
    ps:系统适用性到底该如何验证呢?

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  • fengmo4668

    第5楼2012/07/18

    是。采购了基本上能买到的所有维生素了。

    dahua1981(dahua1981) 发表:风魔这段时间一直在做维生素吗

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  • dahua1981

    第6楼2012/07/18

    应助达人

    不是只为了原创吧

    fengmo4668(fengmo4668) 发表:是。采购了基本上能买到的所有维生素了。

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  • fengmo4668

    第7楼2012/07/18

    怎么可能,我有钱也不能这样子糟蹋呀!更何况我还没有钱呐!

    是我们项目要用的。

    dahua1981(dahua1981) 发表:不是只为了原创吧

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  • happy爱米粒

    第8楼2012/07/18

    谢谢解答,了解了,这类验证貌似很费时费力,此适用性验证是必须要做的吗?

    fengmo4668(fengmo4668) 发表:药典上有专门的规定。
    就是把一个目标物A,经过一系列的破坏试验,让其产生出于目标物A相关的各物质,可能为B、C、D.......等等几个或更多个物质。

    然后试你的色谱条件。在该色谱条件下,所有物质必须达到正常分离。也就是说,各有关物质对你的目标物均不会干扰。此时,你的液相系统适用你的样品检测。

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  • fengmo4668

    第9楼2012/07/18

    必须要做。
    不然,你不知道你的检验结果是否准确。
    一般,系统适用性试验适用于在主峰保留时间附近有别的物质,可能会干扰到主峰的测定的情况时。

    理论上,每次配制流动相后,都要做系统适用性试验。

    木有才(xgy2005) 发表:谢谢解答,了解了,这类验证貌似很费时费力,此适用性验证是必须要做的吗?

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  • happy爱米粒

    第10楼2012/07/18

    也就是走梯度空白?

    fengmo4668(fengmo4668) 发表:必须要做。
    不然,你不知道你的检验结果是否准确。
    一般,系统适用性试验适用于在主峰保留时间附近有别的物质,可能会干扰到主峰的测定的情况时。

    理论上,每次配制流动相后,都要做系统适用性试验。

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