建议 检测的线性范围取决于试验方法的目的，用于含量测定方法的推荐范围为不得过±20%，以峰面积%计的测定杂质的范围是目标浓度的+20%，低至药物或杂质的定量限。在大多数情况下，回归系数要 >0.999，截距和斜率应标明。 D. 精密度 精密度为在相同分析条件下的一组测量值相互接近的程度。ICH定义精密度含有3个部分，即重复性（repeatability）组间精密度（intermediate precision）和重现性（reproducibility）。在USP 1990 ，1225页中的耐用度（ruggedness）具体体现在这一指南的组间精密度，重现性和耐久性（robustness）概念中。 1. 重复性 a. 进样重复性 灵敏度是检出样品中分析对象浓度小量的变化的能力。灵敏度可以通过系统适用性试验中的进样重现性的规定来部分的控制。 多次注射均一样品（制备的溶液）测量的灵敏度和精密度，表明在色谱条件下测定当天HPLC仪器的性能。这一信息作为验证数据和系统适用性试验的一部分。以百分变异系数（CV%）或相对标准偏差（RSD）的规定来测定其分析的变异限度。值越接近人们可以期待结果更精密或对结果的变化更灵敏。这是假设在系统适用性试验后色谱仪功能未失常的情况下的。然而要注意这不是考虑由药品制造和实验室样品制备引起的变异。作为进样和R t的变异的例子，表2提供了在进样过程中色谱系统漏液时收集的数据。四个重复的样品分别进样，注意其峰面积的变异和保留时间的漂移。从性能良好的系统得到的一组典型数据见表3。 表2 进样中色谱系统系统漏液时的重复性数据 样品 R t 峰面积 ΔR t Δ峰面积 A1A2 5.625.66 21556992120466 0.04 35233 B1B2 5.876.13 22056592288355 0.26 82696 C1 C2 6.216.48 22270662265279 0.27 38213 D1 D2 6.736.99 25818882602016 0.26 20128 表3 色谱系统功能正常时的进样重复性数据 剂型 N 均数±SD RSD 吸入溶液 10 1993162±5029 0.25% 吸入用溶液 10 1722253±6288 0.37% 胶囊 10 1744320±3133 0.18% 建议 作为方法验证的一部分，建议最少10次进样，RSD≤1%。对于药物或药物制剂中的活性成分出厂和稳定性研究，其RSD≤1%。系统适用性试验的精密度RSD至少5次进样。对低浓度杂质，较高的变异系数可以接受。 b. 分析重复性 分析重复性由同一分析者在相同的实验条件下进行的多次测量，用RSD表示。实际上，它常常与准确性一起进行研究，见 . A部分准确性项下。 2. 组间精密度 组间精密度以前作为持久稳定性的一部分。该数据用来评价在与方法研究过程不同的条件下的方法可靠性。目的是保证同样的样品在方法研究期后进行分析能得到相同的结果。 取根据时间和条件，方法可以在多天、多个分析工作者和多台仪器上试验。 良好的系统适用性试验规定可以部分地保证试验方法的组间精密度。因此设定严格的但实际的系统适用性试验的规定是重要的。 建议 作为最低要求，在 .A部分准确性项下得到的数据可分为二种不同的情况，来表明试验方法的组间精密度。 3. 重现性 按ICH定义，重现性表示协作研究的实验室间的精密度。要求有多个实验室，但由于企业的规模的原因，不总是能实现的。 建议 如果组间精密度完成了，重现性一般不要求。 E. 范围 范围是指被研究的分析对象的高低浓度间的距离。也可见 .A部分的A和C的准确度和线性项下。 .A部分的A和C的准确度和线性项下推荐的范围能用于其它分析对象，如防腐剂。 F. 回收率 回收率是用目标化合物的量或重量在介质中的理论量的百分数来表示的。 目标化合物应该得到全部回收。在样品制备过程中，目标化合物从处方的赋形剂中回收；处方的模型范围包括简单的水溶液至复杂的乳剂 ，同时从对容器或密闭包装如玻璃瓶和定量阀的可能的吸附中回收。通常样品制备过程简单，回收变异小，回收率数据的收集在 A部分准确度项下讨论。 G. 耐久性（Robustness ） ICH定义耐久性是测量方法不受小的但客观存在的参数变异的影响的能力。耐久性能被良好的系统适用性规定部分的保证。因此设置严格的但可行的系统适用性试验是重要的。 部分或全部改变试验条件，如柱的寿命、柱型号、柱温、流动相中缓冲液的pH、试剂等通常是可以的。 建议 耐久性研究得到的数据一般不上报，但建议作为方法验证的一部分。 H. 样品溶液的稳定性 药物或药物制剂依法制备的溶液的稳定性要按试验方法进行评价，大多数实验室供试品在试验条件下，用自动进样器过夜运行来完成。在试验操作完成前，在实验室环境下，样品在溶液中放数小时。特别要注意能通过水解、光分解或玻璃器皿的吸附而降解的药品。 建议 在常规实验条件下，样品溶液的稳定性的试验应提供一个试验周期的数据，如24小时。在例外情况，样品溶液制备或贮存要多天，那么应该选择一个合适的稳定性试验时间。 I. 专属性/选择性 分析对象应不受其它化合物的干扰，同时与其它化合物也应能很好的分离。应该得到一个代表性的HPLC色谱图或概述上报，该图或概述应能显示加入的已知化合物或加速试验的样品产生的其它峰与母体目标化合物能基线分离。其它峰的的例子如下： ·对于药物或原料，被考虑的有关物质是从合成过程中来的过程杂质（包括异构体）、残留农药、溶剂以及从天然来源中提取的其它成分。 ·对于制剂，有关物资可能是存在在活性物质中的杂质、降解物、赋形剂与活性物质的相互作用产物、额外的成分，如从赋形剂或制造过程中引进的残留溶媒；以及从容器和密闭包装或从制备过程中引进的可滤过和可提取的杂质。 药物加速试验的数据要上报，根据申报的药品和“Guideline for Submitting Samples and Analytical Data for Methods validation”的要求，使用酸、碱水解、温度、光分解、氧化等方法进行加速试验。样品、包括杂质、防腐剂以及空白样品等的加速或不加速的样品的有代表性的色谱图要上报。与杂质试验方法一起，色谱图应表明存在的杂质的检出限 / 定量限要求。色谱图应该是清楚的、有标识的、有时间或时间刻度并且衰减应标明。 注意点 1.主峰可以扩展，如通过增加浓度、改变衰减使可以见到大小合适的额外峰以评价反映稳定性的能力。见.B部分检出限和定量限的建议。 2.基线应在刻度上面 ，因离开刻度的基线（见到的是一条平直的线）可能掩盖小峰。 峰的纯度通过二极管阵列检测器测定，然而目标化合物中存在的低浓度的额外化合物可能不干扰或不影响分析物的UV光谱。 图3和图4说明用二极管阵列检测器的UV光谱图和色谱图。(a)为三维色谱图，(b)为普通色谱图。分析物在4.7分钟流出，应该注意UV光谱图的质量对低浓度化合物是差的。 当用加速试验的样品时，应选择合适的检测器和积分仪，如为能检测0.1%低浓度的降解物，母体峰的检出限至少是0.1%，或面积计数是合理的。 建议 加速和未加速的样品的有代表性的色谱图应上报。包括杂质试验方法、防腐剂等，连同有关的空白样品也一起上报。有代表性的色谱图要以加入已知的额外化合物来标明其选择性。 J. 系统适应性规格和试验 HPLC收集的准确度和精密度数据开始于性能良好的色谱系统。系统适应性 规定和试验则是帮助达到这一目的的参数。本节解释图5指出的术语，并提供 建议和说明。 图中Wx为在5%(0.05)或10%(0.10)峰高处测得的峰宽 f 为在W处峰最大值至峰前沿的距离 t0为死体积或不保留成分的洗脱时间 tR为分析对象的保留时间 tW为直线外推基线处的峰宽 1. 容量因子(k’) k’=(tR-t0)/t0 容量因子是目标峰对死体积，即不保留成分的洗脱时间的比值。 建议 目标峰应该与其他峰和死体积良好地分离。一般k’>2. 2. 精密度/进样重复性(RSD) 以RSD表示的进样精密度表明了HPLC仪器的性能，包括在样品分析时泵、色谱柱和环境的状况。应注意样品制备和制造的变异未予考虑。 建议 RSD≤1% （n≥5） 3. 相对保留时间(α) α=k’1/k’2 相对保留时间为两个峰相对位置的比值，这不是象分离度(RS)的规定，不是基本参数。 4. 分离度(RS) RS=(tR2-tR1)/(1/2)(tW1+tW2) RS表示两个峰被分离好的程度。对于可信赖的定量分析，良好分离的峰对定量是必要的。 如果考虑可能的干扰峰，分离度是非常有用的参数。应选择与分析对象最接近的可能的洗脱峰。RS最小受两种被测量成分比例的影响。峰的分离度RS如图6所示。 分析对象和最接近的可能干扰峰(杂质，附加剂，分解产物，内标等)的RS >2 是合适的。 5. 拖尾因子(T) T=Wx/2f 随着峰拖尾因子的增加定量准确性降低，因为要决定何时、在哪里峰结束，这造成积分峰面积的困难。为分析对象峰面积的最佳计算，积分变量是分析者预设的。 图7和图8表明拖尾因子对定量的影响。如果积分仪不能准确决定何时上升或下降， 那么准确性就要降低。 建议 T≤2 6. 理论塔板数(N) N=16(tR / tW)2 = L/H 理论塔板数是对柱效的测量，它表示在单位色谱运行时间内可以有多少个峰。 在一套固定的色谱操作条件下，每个峰N 基本恒定。H或者HETP为每个塔板相当的高度，测定柱单位高度（L）的柱效。能够影响N或者H的参数包括峰位置、柱内填料颗粒的大小、流动相的流速、柱温、流动相黏度和分析物的分子量。图9表明在两种不同色谱条件下得到的A，B和C三个化合物的色谱图。B的RtS分别为3和8.5分钟。B峰的测定说明尽管出现的峰相似，但理论塔板数是不同的。 Rt N K’ A 1.35 2007 0.51 B 3.00 4702 2.35 C 3.85 5929 3.29
Rt N K’ A 3.36 5076 0.60 B 8.46 7175 3.03 C 10.99 8742 4.23 建议 理论塔板数取决于保留时间，但一般应>2000。 一般建议 系统适应性试验对于保证色谱系统的高性能是重要的。试验要求的数量取决于试验方法的目的。对于溶出度，释放度这类试验方法k’，T，和RSD是最低推荐的系统适应性试验。对于验收、出厂、稳定性试验、或杂质和降解物的测定，用外标法或内标法；k’、T、Rs和RSD被推荐为最低系统适应性参数。实际上验证每一种方法都应当适宜数量系统适应性试验，以规定必要的系统特性。在申请者和评审者慎重时，可选择附加试验。 K. 要点 试验方法中应该注意的某些基本点 1.样品和对照品都应该溶解于流动相中，如果不可能，避免使用比流动相浓度 高得太多的有机溶剂。 2.样品和标准品浓度如果不同，应该接近。 3.样品在分析过程中应该用标准品同时测定 4.进样前样品过滤有时碰到。过滤将除去能填塞柱子的颗粒。分析对象被吸附也能发生，这对低浓度杂质尤其重要。申请者这方面的验证数据要上报。 V. 建议和结论 药物及其制剂的HPLC方法 方法不应该只验证一次，而应该由开发者或者使用者验证和设计以保证方法自始至终的持久稳定性或一致性。 药物制剂制造过程，实验室样品的制备操作和仪器性能变异都影响分析得到数据的准确性。应有适当的验证和严格的色谱性能（系统适应性规定），才能得到更可靠的数据。除药品制造过程以外的变异都应最小化。只有经过良好可信验证过的方法，用于出厂，稳定性和药物代谢动力学的数据才是有价值的。 VI. 致谢 感谢Hoiberg， poochikian， Blumenstein， Look和Tilgyesi博士（HFD－150) Layoff博士(HFH300) Zirmmerman和Piechocki博士(HFD-110) 以及分析方法技术委员会的Sheinin博士，Shostak先生，Cunningham女士， Jongedyk女士，Leutzinger先生，Seggel博士，Sharkey女士和Smela先生 的宝贵建议。 VII. 参考文献 1.Guideline for Submitting Samples and Analytical Data for Methods Validation ，February 1987. 2.United States Pharmacopeia ， ，1990(1225). 3.Text on Validation of Analytical Procedures ，International Conference on Harmonization ，September 1993.
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