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测定大麦、小麦种子纯度

  • fangjunbiy
    2012/09/10
    《分析仪器》
    • 私聊

PCR

  • 测定大麦、小麦种子纯度

    (参考)





    A1 原理

    从种子中提取的醇溶蛋白在凝胶的分子筛效应和电泳分离的电荷效应组成作用下得到良好的分离，通过显色显示蛋白质谱带类型。不同品种由于遗传不同，种子内所含的蛋白质种类有差异，这种差异可利用电泳图谱加以鉴别，从而对品种真实性和纯度进行鉴定。

    A2 仪器和试剂

    A2.1 仪器

    电泳仪(满足稳压500V)，离心机，垂直板电泳槽，钳子，5mL、10mL移液管，微量进样器，聚丙烯离心管。

    A2.2 试剂

    尿素、乙醇、甘氨酸、甲基绿、三氯乙酸、冰乙酸、过氧化氢、硫酸亚铁、抗坏血酸、α-巯基乙醇、丙烯酰胺、考马斯亮蓝R-250，甲叉双丙烯酰胺、α-氯乙醇。

    A3 程序

    A3.1 药剂配制

    A3.1.1 蛋白质提取液

    小麦：0.05g甲基绿溶于25mLα-氯乙醇中，加蒸馏水至100mL。低温保存。

    大麦：0.05g甲基绿溶于20mLα-氯乙醇中，加入18g尿素，再加入1mLα-巯基乙醇，加蒸馏水至100mL。低温保存。

    A3.1.2 电极缓冲液

    0.4g甘氨酸加蒸馏水溶解，加4mL冰乙酸，加蒸馏水至1000mL。低温保存。

    A3.1.3 凝胶缓冲液

    1.0g甘氨酸加蒸馏水溶解，加入20mL冰乙酸，定容至1000mL。低温保存。

    A3.1.4 0.6%过氧化氢

    30%过氧化氢2mL加蒸馏水定容至100mL。低温保存。

    A3.1.5 染色液

    0.25g考马斯亮蓝加25mL无水乙醇溶解，加入50g三氯乙酸，加水至500mL。

    A3.1.6 凝胶液

    丙烯酰胺20g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，尿素12g，硫酸亚铁0.01g，抗坏血酸0.2g，用凝胶缓冲液溶解并定容至200mL。低温保存。

    A3.2 样品提取

    一般每个样品测定100粒种子，若更准确地估测品种纯度，则需更多的种子。如果分析结果要与某一纯度标准值比较，可采用顺次测定法(sequential testing)来确定，即50粒作为一组，必要时可连续测定数组，以减少工作量。如果只鉴定真实性，可用50粒。

    取小麦或大麦种子，用钳子逐粒夹碎(夹种子时，最好垫上小片清洁的纸，以便于清理钳头和防止样品之间的污染)，置1.5mL离心管中，加入蛋白质提取液(小麦0.2mL，大麦0.3mL)，充分摇动混合，在室温下提取24h，然后在18000×g条件下离心15min。取其上清液用于电泳。

    A3.3 凝胶制备

    从冰箱中取出凝胶溶液和过氧化氢溶液，吸取10mL凝胶溶液，加1滴0.6%过氧化氢，摇匀后迅速倒入封口处，稍加晃动，使整条缝口充满胶液，让其在5-10min聚合封好。

    吸取45mL凝胶溶液，加3滴0.6%过氧化氢，迅速摇匀，倒入凝胶板之间，马上插好样品梳，让其在5-10min内聚合。

    A3.4 进样

    小心抽出样品梳，将玻璃板夹在电泳槽上，用滤纸或注射器吸去样品槽中多余的水分，然后用微量进样器吸取10-20μL样品加入样品槽中。

    A3.5 电泳

    在前后槽注入电极液，前槽接正极，后槽接负极。然后打开电源，逐渐将电压增加到500V。电泳时，要求在15-20℃温度下进行。电泳时间一般为60-80min，具体时间可按甲基绿迁移时间来推算，电泳时间为甲基绿移至前沿所需时间的2-2.5倍。

    A3.6 染色

    将胶板小心地取下，在染色液中染色1-2d。一般情况不需要脱色，但为使谱带清晰，可用清水冲洗。

    A3.7 鉴定

    谱带命名可采用相对迁移率法或电泳程式法。根据醇溶蛋白谱带的组成和带型的一致性，并与标准样品电泳图谱相比较，鉴定种子真实性以及测定品种纯度。

    附加说明：

    本标准由中华人民共和国农业部提出。

    本标准由全国农作物种子标准化技术委员会归口。

    本标准由全国种子总站、浙江农业大学、四川省、黑龙江省、天津市种子公司(站)、南京农业大学、北京市、湖南省种子公司负责起草。

    本标准主要起草人支巨振、毕辛华、杜克敏、常秀兰、杨淑惠、任淑萍、吴志行、李仁凤、赵菊英。

    本标准首次发布于1983年3月。

    本标准参照采用国际种子检验规程(ISTA，1993版)第八部分 种及栽培品种的鉴定。
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  • 编辑lily

    第1楼2012/09/24

    后面的附加说明是怎么回事啊？这是一个国家标准么？

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