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【“特色”应用方法】中药材黄曲霉毒素检测色谱柱的选择

  • nanjingcpu
    2012/12/02
  • 私聊

厂商论坛

  • 实验背景

    黄曲霉毒素(AFT)是由黄曲霉和寄生曲霉产生的一组结构类似的二呋喃香豆素代谢产物,常见的有黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2等,其中B1含量较高、毒性和致癌性最强,急性毒性是氰化钾的10倍,砒霜的68倍。慢性毒性可诱发肝癌。中药材在采集、加工、运输、贮藏过程中如保存不当很容易受潮霉变而污染黄曲霉毒素,《中国药典》2010年版一部附录新增黄曲霉毒素测定法,规定有5个药材品种(僵蚕、胖大海、酸枣仁、陈皮、桃仁)规定了该项限度检查。其中黄曲霉毒素B1限量不超过5ug/kg、黄曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)限量不超过10ug/kg。传统的检测方法有柱后碘衍生,药典委员会于2012年201264在网站公布:关于《中国药典》2010版一部附录黄曲霉毒素测定法和农药残留量测定法增修订内容的公示

    http://www.chp.org.cn/cms/business/add-acc/addendum/000019.html

    指出:根据有关单位研究结果,经第十届药典委员会相关专业委员会审定,拟在《中国药典》一部附录IX V“黄曲霉毒素测定法”中增加柱后光衍生检测方法,与柱后碘衍生检测法并列

    检测条件

    1. 仪器及试剂

    1.1 仪器 Waters 2695高效液相色谱仪Waters 2475荧光检测器;HM 11104光化学衍生器;高速均质器(IKA);AL 204电子天平(Mettler);低速大容量离心机,AflaTest #G1010黄曲霉毒素免疫亲和柱(VICAM);玻璃纤维滤纸(VICAM)。

    1.2 试剂和标准物质 黄曲霉毒素混合对照品溶液(SUPELCO黄曲霉毒素G2G1B2B1浓度分别为0.31.00.31.0 ug·ml-1),甲醇、乙腈均为色谱纯,所用水为超纯水(MILLIPORE)。

    2. 色谱条件

    色谱条件:AgelaVenusil MP C18色谱柱(250×4.6 mm,5 um),甲醇-乙腈-水(30:20:50)为流动相,流速0.8 ml·min-1,柱温30激发波长365nm,发射波长450nm




    实验过程

    选取色谱柱1(AgelaVenusil MP C18),色谱柱2(某国产品牌C18),色谱柱3(某国外品牌C18),在2色谱条件下,选取同一对照品黄曲霉毒素G2G1B2B1浓度分别为0.31.00.31.0 ng·ml-1。各进样10ul,记录结果如下

    实验结果



    B1

    RSD



    B2

    RSD



    G1

    RSD



    G2

    RSD



    色谱柱1

    204458.3

    0.26

    143970.3

    0.76

    156901.3

    0.67

    110210.7

    1.1



    色谱柱2

    227719

    1.46

    164143.3

    1.7

    169542

    1.59

    130293.3

    0.62



    色谱柱3

    176241

    0.81

    127623.7

    1.06

    136720

    0.6

    105299.7

    1.04



    色谱柱1色谱图(从左至右分别为黄曲霉毒素G2G1B2B1

    色谱2色谱图(从左至右分别为黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1色谱柱3色谱图(从左至右分别为黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1


    结论

    从色谱图和峰面积中可以发现Venusil MP C18相对其他两种色谱柱具有一定优势,前期试验中发现,两外两种色谱柱进样数次后有柱压较高,基线不平,易出现杂峰等缺点,而Venusil MP C18则没有这些缺点,色谱系统压力一直维持在1600psi左右。这可能和填料表面键合技术有关。

    中药材基质复杂,在进入色谱柱前加入预柱对延长色谱柱使用寿命,改善峰型有较好的作用,特别是大批量,不同品种常时间进样时,使用预柱的效果更为明显,当然常时间用后需要跟换里面的滤芯,一般用高有机相冲冲就行,但是千万不能像处理HPLC在线过滤器滤芯拿去超声,否则会毁坏预柱。






    附:样品处理过程图

    供试品溶液配制:精密称取样品粉末 (过二号筛)15 g,加入氯化钠3 g和70%甲醇75 ml,高速搅拌3 min(搅拌速度大于11000r·min-1),离心5 min(离心速度3000 r·min-1),精密吸取上清液15 ml,置50 ml量瓶,加水定容,摇匀,取玻璃纤维滤纸滤过,取续滤液20 ml,加入免疫亲合柱 (流速3 ml·min-1),用水20 ml洗脱(流速6 ml·min-1),弃去洗脱液,再用甲醇洗脱(流速1 ml·min-1),收集甲醇洗脱液2 ml,摇匀,即得。如图




    附:为进一步加强中药材的质量控制,根据国家食品药品监督管理局的部署和安排,经我委组织有关单位和专家对黄曲霉毒素、重金属及有害元素、农药残留量等有害物质的控制方法、限度值以及重点品种进行试验研究,拟在2010年版《中国药典》的基础上,进一步增加中药的安全性指标控制项目,尤其是加强对中药材中重金属及有害元素、黄曲霉毒素、农药残留量的控制。关于中药中重金属、农残、黄曲霉毒素等物质限量标准草案的公示http://www.chp.org.cn/cms/business/cm/000127.html
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  • yuduoling

    第1楼2012/12/02

    用的安的柱子啊?

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  • nanjingcpu

    第2楼2012/12/02

    这个保密吧,行家?

    yuduoling(yuduoling) 发表:用的安的柱子啊?

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  • 博纳艾杰尔

    第3楼2012/12/02

    咦?有行家?有内幕?快说来听听!愿闻其详哦~

    LZ帖子已经记录并做了处理,感谢对本活动的支持,谢谢!

    nanjingcpu(xanaducpu) 发表:这个保密吧,行家?

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  • nanjingcpu

    第4楼2012/12/02

    咦?有行家?有内幕?快说来听听!愿闻其详哦~
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    内幕不敢说,说说经验吧

    在前期试验中,试过好几种色谱柱,名字就不报了,否则厂家人肉我,他们出现的状况是这样的:

    1有的基线一直往下飘,

    2有的柱压直逼4000,色谱柱不是进口端漏,就是下口端漏,“上吐下泻”再形容不过了,有几次吧waters的在线过滤器连接的那个peek阀都冲漏了,因为压力太大了,最后换回了原配的不锈钢的接头,才扛得住这高压,但是色谱柱依然扛不住,压力不断往上升1800,2200,2800,3000,3300,直到超过4000psi就彻底OVER了,关键是进样时,压力往往会瞬间冲高,所以走流动相时,压力不能太高。

    3 进样十多次后,峰型就不行了,都是肩峰,形状目不忍视。

    直到艾杰尔 mp c18柱出现后,基线平稳了,峰分的很开了,实验故障减少了(开个玩笑)

    后来查阅文献资料发现,最主要还是键合相有关,也有几款国外知名名牌做的不错,测黄曲霉毒素就这类键和相分离的好,只能说这类柱子更适合用于检测aftoxin,其他的色谱柱更适合于测其他物质。

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  • 博纳艾杰尔

    第5楼2012/12/02

    内幕不敢说,说说经验吧

    在前期试验中,试过好几种色谱柱,名字就不报了,否则厂家人肉我,他们出现的状况是这样的:

    1有的基线一直往下飘,

    2有的柱压直逼4000,色谱柱不是进口端漏,就是下口端漏,“上吐下泻”再形容不过了,有几次吧waters的在线过滤器连接的那个peek阀都冲漏了,因为压力太大了,最后换回了原配的不锈钢的接头,才扛得住这高压,但是色谱柱依然扛不住,压力不断往上升1800,2200,2800,3000,3300,直到超过4000psi就彻底OVER了,关键是进样时,压力往往会瞬间冲高,所以走流动相时,压力不能太高。

    3 进样十多次后,峰型就不行了,都是肩峰,形状目不忍视。

    直到艾杰尔 mp c18柱出现后,基线平稳了,峰分的很开了,实验故障减少了(开个玩笑)

    后来查阅文献资料发现,最主要还是键合相有关,也有几款国外知名名牌做的不错,测黄曲霉毒素就这类键和相分离的好,只能说这类柱子更适合用于检测aftoxin,其他的色谱柱更适合于测其他物质。[/quote]

    果然没看错,LZ实力极强。这文就是传说中有图有真相的震撼出击。版友有技术问题可以跟LZ讨论~我先看看,不说话,呵呵……

    nanjingcpu(xanaducpu) 发表:咦?有行家?有内幕?快说来听听!愿闻其详哦~
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  • nanjingcpu

    第6楼2012/12/02

    果然没看错,LZ实力极强。这文就是传说中有图有真相的震撼出击。版友有技术问题可以跟LZ讨论~我先看看,不说话,呵呵……[/quote]

    欢迎各位网友来拍砖!学习交流,共同进步,特别是色谱方面的技术问题,用了一年多,积累了一些经验,GC,HPLC,UPLC,UV,IR等各种联用技术,最近准备弄弄aas,ICP-MS,还是菜鸟,还在学习中

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  • 博纳艾杰尔

    第7楼2012/12/02

    欢迎各位网友来拍砖!学习交流,共同进步,特别是色谱方面的技术问题,用了一年多,积累了一些经验,GC,HPLC,UPLC,UV,IR等各种联用技术,最近准备弄弄aas,ICP-MS,还是菜鸟,还在学习中[/quote]

    恩。版友们都来切磋切磋吧。高手间的较量,一定很精彩,呵呵。LZ,刚给您了封站短,请看下,谢谢!

    nanjingcpu(xanaducpu) 发表:果然没看错,LZ实力极强。这文就是传说中有图有真相的震撼出击。版友有技术问题可以跟LZ讨论~我先看看,不说话,呵呵……

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  • houjjun

    第8楼2012/12/02

    做的不错啊,方法也有了,内容也有了,顶一个

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  • amandali

    第9楼2012/12/03

    我们也有免疫亲和柱哦!看下这个应用链接,也很不错吧?

    http://www.agela.com.cn/Doload.aspx?id=12

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  • amandali

    第10楼2012/12/03

    楼主用过我们家的亲和柱吗?看下我们的应用案例,效果怎么样?
    http://www.agela.com.cn/Doload.aspx?id=12

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