伍丰液相原创技术资料（仪器选购、使用、保养常识等）

二、液相色谱仪的最小检测浓度和流通池的光程（体积）之间的关系与含义

某些国产仪器在公布其技术指标时，大多只写了“噪音和漂移”的指标。用户觉得指标都差不多，但却忽略了另外二个较为重要的指标：“最小检测浓度和光程”，这二个指标有什么作用呢？它们代表了什么含义？

这里来解释一下：

最小检测浓度是考验仪器的灵敏度。最小检测浓度数值大，仪器的灵敏度就小，不能反应真正的噪音和漂移水平。例如：我公司的最小检测浓度小于1×10-8g/ml (萘/甲醇溶液)，而某些仪器是：4×10-8g/ml (萘/甲醇溶液)。这就说明我们的仪器灵敏度大，可以检测更微量的样品。同样如我公司仪器把最小检测浓度调较得和其它产品是一样，也就表明我们可以做得比其它产品噪音和漂移低4倍。

可以从这个公式看出：

最小检测浓度=2×仪器的噪音×进样的样品浓度/样品的峰高值

那光程又代表什么？我们先看下面一个公式，比尔定律：
A=log(I0/I)=εCL

A是吸收率；I0代表参照池的光强；I为样品池的光强；ε为摩尔吸光系数；C是样品浓度；L就是流通池的光程。

可以看出在同样的“C”样品浓度情况下，“L”流通池的光程越大,仪器的“A吸收率”也就越大。这样可以检测到的样品浓度就越小。为什么有些厂家把仪器的流通池光程做得很小，有些只有：3.5mm、4.5mm或5.5mm，而不是我公司的8mm。这是因为这些厂家不能有效的降低整个系统的“噪音和漂移水平”，只能牺牲流通池光程，也就是牺牲了仪器的检测灵敏度和最小检测浓度，来达到降低“噪音和漂移水平”目的。用通俗的说法比喻：HPLC就是一台音响，光程就是这台音响的音量控制键，光程越小就是把音量调小了，耳朵对音响本身的噪音和失真（可以理解为仪器的噪音和漂移）感觉就越小。但也就说明了这些仪器整体系统的制造水平不高。

三、液相色谱仪对流动相的要求

1.首先必须是HPLC级的，这一条相信大家都做到了。
2.脱气。由于流动相里含有微量空气，经泵的压力作用，会在流通池里产生气泡，这对分析产生一定的影响，如噪音增大，甚至于掩盖信号峰。因此，流动相在使用前必须经超声脱气30分钟以上。
3.过滤。由于流动相里有很微小的垃圾，如不经过过滤，偶尔会卡在单向阀门中，从而产生压力波动。这一点很多用户不太注意，等到产生压力波动又不知道什么原因产生的。

四、高效液相色谱系统中气泡对检测的影响及其解决方法

在我们进行液相色谱分析时，有时会遇到这样一个问题：系统的流路中存在气泡。
由于气泡的存在，会造成色谱图上出现尖锐的噪声峰，严重时会造成分析灵敏度下降；气泡变大进入流路或色谱柱时会使流动相的流速变慢或不稳定，使基线起伏。
造成上述现象的主要原因有三条：一是流动相溶液中往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡；二是系统开始工作时未能将流路中的空气驱赶干净；三是在注入样品时不注意混入了空气。
为了避免这类问题的出现，液相色谱实际分析过程中必须重视对流动相进行脱气处理。
常用的脱气方法有以下几种：
1.吹氦脱气法 使用在液体中比空气溶解度低的氦气，在0.1Mpa压力下，以约60ml/min流速通入流动相10-15min以驱除溶解的气体。此法使用于所有的溶剂，脱气效果较好，但在国内因氦气价格较贵，本法使用较少；
2.加热回流法 此法的脱气效果较好；
3.抽真空脱气法 此时可使用微型真空泵，降压至0.05-0.07MPa即可除区溶解的气体。显然使用水泵连接抽滤瓶和G4微孔玻璃漏斗可一起完成过滤机械杂质和脱气的双重任务。由于抽真空会引起混合溶剂组成的变化，故此法适用于单一溶剂体系脱气。对多元溶剂体系应预先脱气后再进行混合，以保证混合后的比例不变。
4.超声波脱气法 它是目前实验室使用最广泛的脱气方法，将配制好的流动相连同容器一起放入超声波水漕中脱气10-20min即可。该方法操作简便，基本能满足日常分析的要求。
5.在线真空脱气法 把真空脱气装置串联到储液系统中，并结合膜过滤器，实现了流动相在进入输液泵前的连续真空脱气。此法的脱气效果明显优于上述几种方法，并适用于多元溶剂体系。
其二，在液相色谱系统开始工作前，可以用注射器连接恒流泵的排空阀，抽入流动相，将流路中的空气驱赶干净。
其三，在注入样品前注意排出样品注射器中的空气。

五、液相色谱系统的日常维护及注意事项（之一）

仪器安装条件与注意事项

安装本仪器的实验台应水平、稳固、并具有足够的放置空间。避免在具有腐蚀性气体、大量灰尘或能产生强磁场的地方安装本仪器，否则将会影响仪器的正常运转及缩短仪器的使用寿命。
由于仪器所用溶剂是易燃并且有毒，故安装设备的房间应通风良好，应具有向外排风的装置，否则可能会引起中毒或身体不适，也可能会引起火灾。
应安装四个以上三芯电源插座（220V，5～10A），必须具有专门的接地线（注意,绝不能将电源线的中线作为接地线），并确保输出电源的电压稳定，否则会导致仪器的不正常运作。
如果实验室无专用的接地线，一般可用Φ15～20mm的铜棒打入地下1～1.5米，用Φ1.2mm左右的塑胶单股导线连接到电源插座的接地端。
如果实验室电压不稳定，应使用稳压器等必要设备，使电源电压稳定。
实验室的室温应控制在15℃-30℃范围内，并且波动要小；湿度在45～85%范围内。
由空调或其他设备产生的气流不要直吹仪器，避免光线直射及振动。
仪器的启动顺序：先开高压恒流泵和紫外检测器，待紫外检测器自检完毕，回到默认波长254nm后，再开计算机及打开工作站软件。
仪器关闭顺序：先按泵停止，关闭氘灯，退出工作站软件，然后再关仪器。
仪器应由专人负责，如果使用人员不固定，请准备《仪器使用登记本》，以明确使用情况，及时处理和保养。

六、液相色谱系统的日常维护及注意事项（之二）

流动相使用的注意事项

必须使用HPLC级或相当于该级别的流动相，并要先经0.45μm薄膜过滤。
过滤后的流动相必须经过充分脱气，以除去其中溶解的气体（如O2），如不脱气易产生气泡，增加基线噪声，造成灵敏度下降，甚至无法分析。

几中脱气方法比较：
1.氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。
2.加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。
3.抽真空脱气法：易抽走有机相
4.超声脱气法：一种较为常见的脱气法。流动相放在超声波容器中，用超声波震荡10～15分钟，此法效果并不是太好，但操作简单。
如果管路中使用peek树脂部件，请不要使用下列流动相：
浓硫酸、浓硝酸、二氯乙酸、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿和二甲基亚砜

特别注意：
含有缓冲盐溶液的流动相的清洗方法：
1．先用10︰90的甲醇/水冲洗，以洗去缓冲盐，清洗时间至少为一小时。
2．再用90︰10的甲醇/水，冲洗系统，并将系统保存在该流动相中。清洗时间至少为40分钟。


补充参考资料（本人转贴）：使用缓冲液的注意事项：

缓冲液可以提供离子平衡的反离子，并使流动相保持一定的离子强度和pH值，减少拖尾。
但是使用缓冲液要注意几点：
1、避免使用盐酸盐，盐酸盐对钢质有腐蚀作用。
2、缓冲液最好要现配现用，往往缓冲液是良好的菌类培养液，隔天或放置长时间实验时会有很多怪现象发生。
3、实验后不可用有机溶剂直接过度，有机溶剂会处使盐类析出，造成液路或色谱柱堵塞，可用95：5的水甲醇冲洗。
4、使用缓冲液要及时掌握pH范围，做到胸中有数。
5、清洗液路和柱子时，有温控可加热到30摄氏度易于冲洗。
6、长时间用缓冲溶液要注意观察接头处有无析出，若有白色盐类析出，可考虑一定周期用10%硝酸冲洗一下液路（拆下柱子，走30ml,再用5倍水冲洗）可以避免液路的堵塞。
7、选择缓冲液要用可靠的试剂，避免不纯的盐类造成不必要的麻烦。

七、液相色谱系统的日常维护及注意事项（之三）

流动相的更换

在分析过程中，有时需要更换流动相进行分析。一定要注意前一种使用的流动相和所更换的流动相是不是能够相溶。如果前一种使用的流动相和所更换的流动相不能够相溶，那您就要特别注意了。要采用一种与这二种需更换的流动相都能够相溶的流动相进行过渡、清洗。较为常用的过渡流动相为异丙醇，但实际操作中要看具体情况而定，原则就是采用与这二种需更换的流动相都能够相溶的流动相。一般清洗的时间为30～40分钟，直至系统完全稳定。

如不进行以上“特别注意”上述步骤的操作，将会导致系统管路堵塞。严重时将引起流通池污染堵塞，不得不更换流通池。用户就要承担不必要的损失了。

储液器的注意事项：
保持流动相储液器的清洁是保证仪器正常使用的关键。要使用HPLC级的溶剂，对试剂含有缓冲盐及非HPLC级的流动相一定要用0.45μm过滤器除去其中的微粒物质。

八、液相色谱系统的日常维护及注意事项（之四）

管路连接的注意事项

1.将管子完全插入开口端，直至其与开口端的末端相碰为止。否则将产生死体积，引起峰展宽。
2.为了使柱外效应减到最小，获得理想的分析结果，尽量使用管径细的管路作为连接。
3.管路接头不要拧的过紧，以防损坏螺纹。

九、液相色谱系统的日常维护及注意事项（之五）

基本操作注意事项

泵运行前先打开排空阀，用注射器抽出流动相，观察10秒，流动相应连续流出。
不用排空阀时应将其关闭，否则大气压力会使流动相从排空阀出口流出。
在使用仪器过程中，注意贮液瓶里的流动相是否够用，如快用尽，应及时更换。
更换流动相时务必停泵，防止吸入大量空气，影响仪器正常运作。
在启动分析进样时，请快速板动7725i进样阀，否则会引起系统压力突跳，影响仪器的使用寿命。
如对样品分析的定性定量要求较高，应配置柱温箱，保持温度恒定。
若流动相不是纯甲醇，样品分析结束后，必须用HPLC级甲醇对泵及进样阀进行清洗，大约半小时后，待压力重新回落并稳定，方可关泵。
若流动相中含有缓冲盐，则须根据其特殊的清洗方法进行清洗（上述提到过）。

十、液相色谱系统的日常维护及注意事项（之六）

氘灯的保养

紫外检测器中的氘灯是有一定的使用寿命的。为了节省灯的使用寿命，在暂时不使用时可在不关机的情况下，只把灯关掉（建议：最好在需要关灯时间4小时以上才关灯，因为频繁的开关灯，同样会缩短灯的使用寿命）。