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骨髓细胞的提取

省部重点实验室

2013/02/21

生命科学仪器综合讨论

名称：骨髓细胞的提取
目的：分离并培养骨髓间充质干细胞
原理：先分离出单核细胞然后再通过培养分离出骨髓间充质干细胞
内容：
步骤一：小鼠骨髓细胞的获取

1．断颈处死小鼠（7-12周，雌雄均可），投入盛有250ml左右的0.1%新洁尔灭或75%酒精中浸泡3-5分钟，拎出后将小鼠仰面翻铺于超净台上一个消毒托盘上。
2．用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。将它们放入另外一个消毒托盘中，并换一套新的剪子和镊子。手术器械事先均必须消毒。
3．小心剥离肌肉，分别剪下Femurs and Tibias, 剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔。注意尽可能少的剪走骨髓腔。
4．拿两支5ml无菌注射器，每支吸取5ml IMDM(10%FBS, 50/50u/ml Pen/Strep)，换装一个4号针头（又称皮针）或1ml注射器的针头，并用无菌的针头套管将之轻轻拧弯。轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌15ml离心管，将细胞冲出。每根骨用2.5ml IMDM培养液左右即可基本冲下骨髓腔内的细胞。
5． <300C下离心，1200转/10分钟，去上清，但留1ml，以便用于在振荡器上悬浮细胞。
6．加进氯化铵溶液（NH4Cl: 8.99g/L, KHCO3: 1g/L, Na4-EDTA: 0.037g/L ，过滤灭菌, 40C储存）裂解红细胞，按1: 9比例，即1ml 细胞悬液，加进9ml氯化铵溶液，混匀，冰上10分钟。
7． <300C离心，1200转/10分钟，去上清。

步骤二：淋巴细胞分离液分离小鼠骨髓细胞

1．按步骤二方法采集小鼠骨髓细胞，并破红细胞
2．细胞用4ml培养液悬浮，缓慢留置于8ml淋巴细胞分离液液面上，2000rpm for 20min.
3．小心吸取云雾状底层的基质细胞约1.5ml的体积，置于1个盛有1ml无菌细胞培养用PBS的15ml离心管中，颠倒混匀，1200rpm for 10min, 去上清
4．如果是注射用细胞，则用5ml PBS洗涤细胞2次；
5．离心沉淀下来的细胞用50-200ul PBS，计数细胞，并计算所需细胞体积数铺板培养

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