默克密理博应用实验室 2013-05-22
近日，台湾多地食用淀粉产品中被检测出含有违法添加物“顺丁烯二酸”（又名马来酸，Maleic Acid），这些产品涉及粉条条、肉圆、珍珠奶茶中的珍珠等食品。淀粉中产品中被检出顺丁烯二酸是因为淀粉厂家在制造改性淀粉时使用了顺丁烯二酸酐(Maleic anhydride)，顺丁烯二酸酐能与淀粉羟基反应形成粘度高、水溶性强的改性淀粉，使用改性淀粉的食品口感更好、颜色亮、更有且筋道。顺丁烯二酸酐遇水即水解生成顺丁烯二酸。目前，我国、欧美及世界卫生组织均没有批准顺丁烯二酸作为食品添加剂用于淀粉中。GB/T23296.21-2009方法中使用C18柱、离子对试剂测试食品接触材料、高分子材料、食品模拟无中的顺丁烯二酸及顺丁烯二酸酐。
默克密理博致力于分析方法的开发，为客户提供简便、快速的解决方案。顺丁烯二酸极性较强，易溶于水，适合使用默克密理博的两性离子型亲水作用色谱柱(ZIC-HILIC)分离。同时，顺丁烯二酸（pKa1=1.83, pKa2=6.07）在一定的pH条件下易电离产生负离子，能与两性离子色谱柱中的正离子结合，加强了化合物在色谱柱上的保留。
本实验采用默克密理博两性离子型（ZIC-HILIC）色谱柱家族中的磷酸胆碱键合相ZIC-cHILIC色谱柱，开发了直接分析顺丁烯二酸的液相色谱方法。该方法前处理简单，不需要衍生化，也不需要添加离子对试剂。其原理见图1所示。
图1 ZIC-cHILIC色谱柱分离机理
1.材料试剂
1.1 顺丁烯二酸（C4H4O4）对照品（默克密理博，货号：8.17058.1000 ）
1.2 色谱柱：ZIC-cHILIC 250-4.6mm 3um 100A（默克密理博，货号：1.50662.0001）
1.3 乙腈（默克密理博，货号：1.00030.4008）
1.4 甲醇（默克密理博，货号：1.06007.4008）
1.5 磷酸二氢钾（默克密理博，货号：1.04873.1000）
1.6 磷酸氢二钾（默克密理博，货号：1. 05104.1000）
1.7 磷酸（默克密理博，货号：1. 00573.1000）
1.8 食用淀粉
1.9 某品牌饼干
1.10 实验用为为超纯水（默克密理博Milli-Q Advantage）
1.11 PVDF0.22um针头过滤器（默克密理博，货号：SLGV033NB）
1.12 70%乙腈溶液:350mL 乙腈（1.3）加150ml水（1.9）混合
1.13 50%乙腈溶液：250mL乙腈（1.3），加250mL水（1.9）混合
1.14 1%碳酸氢铵水溶液
1.15 标准溶液配制：取25mg顺丁烯二酸对照品，于25mL容量瓶中，加70%乙腈溶液（1.12）溶解，定容，得1mg/ml对照品母液。母液用70%乙腈溶液逐级稀释后，得1ug/mL的标准溶液。使用该标准溶液，配制浓度为0.02-1.0ug/mL的标准工作液。
1.16 样品前处理：取1.0g样品与50mL PP离心管中，加50%乙腈溶液25mL，摇振60s，超声10min，再摇振60s，加入1%碳酸氢铵溶液20mL，混匀，再定容至50mL。静置5min，取上清液500ul于5mL容量瓶中，加70%乙腈混合，定容。样品溶液经滤膜过滤，得供试液。(注：样品处理时可采用0.5M氢氧化钾溶液进行皂化处理，再用盐酸溶液调成中性，稀释后检测。)
2.测试条件
2.1 液相色谱仪：Agilent 1260 HPLC
2.2 色谱条件
色谱柱:ZIC®-cHILIC PEEK 250-4.6 3um(1.50662.0001)
流动相:乙腈/磷酸缓冲盐（20mM K2HPO4 PH7.0 用磷酸调节)=77：23
检测波长：214nm
柱温:40C
流速:1mL/min
进样体积: 20ul
3 测试结果
3.1对照品测试
图2 顺丁烯二酸溶液(0.2ug/ml)
主峰保留时间约5.4分钟，理论塔板数7339，对称因子0.79。重复进样5针，RSD为0.85%。
3.2 校准曲线
配制0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0ug/ml的顺丁烯二酸对照品溶液，分别进样检测。根据浓度与峰面积值绘制校准曲线，线性方程y=113.19x+0.4315，R2=0.9998。结果如图3所示。
图3 校准曲线
结果表明，在0.02-1.0ug/ml之间，线性关系良好。
3.3 加标回收及精密度试验
淀粉空白按照方法（1.16）处理，结果显示在顺丁烯二酸保留时间附近没有干扰峰。
图4 淀粉空白溶液
取1.0g空白淀粉样品，分别加入不同量的顺丁烯二酸，经过处理后测定，计算加标回收率，见表1
图5 空白样品加标（50ug/g）
表1 加标回收及精密度实验
| 加标浓度（ug/g） | 回收率 | RSD |
| 50 | 114.0% | 7.6% |
| 150 | 103.0% | 3.4% |
| 450 | 99.0% | 1.5% |
3.4 检测限
信噪比为3时，顺丁烯二酸的浓度为0.005ug/ml（LOD）
图6 低浓度的顺丁烯二酸标准溶液图谱（0.01ug/ml）
3.5 样品测试
取1.0g某品牌饼干样品，按照方法处理，检测。结果显示未到顺丁烯二酸。
图7 某品牌饼干样品的测试图谱
4 结论
采用ZIC-cHILIC色谱柱，直接分析淀粉及食品中的顺丁烯二酸与顺丁烯二酸酐。方法在0.02-1.0ug/ml范围内线性关系良好，操作简单，重现性良好，LOD=0.05ug/ml。
备注：
1 本方法测试顺丁烯二酸及顺丁烯二酸酐总量；
2.所采用的色谱柱需能有效将顺丁烯二酸、醋酸、苹果酸及琥珀酸等分离(见默克密理博相关应用)；
3.食品中有杂质影响时，可调节流动相比例、pH、流速解决；
4.以LCMS进行测试时，流动相中的缓冲盐改为20mM的醋酸铵溶液。色谱柱选用2.1mm内径的ZIC-cHILIC色谱柱；
5.LC/MS多反应监测（MRM）模式参数参考：
| 化合物 | 离子化模式 | 离子对 | 去簇电压(V) | 碰撞能量(eV) |
| 顺丁烯二酸 | ESI- | 115>71（定量） | -15 | -11 |
| 115>32 | -15 | -28 |
色谱柱推荐
| 应用 | 描述 | 订货号 |
| HPLC | ZIC-cHILIC PEEK 250-4.6 3um | 1.50662.0001 |
| LC/MS | ZIC-cHILIC PEEK 150-2.1 3um | 1.50658.0001 |
更详细信息请联系默克密理博。
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