孩老爹
第4楼2013/08/25
革兰氏染色
①用枪头滴一滴菌液于载玻片上,并均匀涂开,待干后在酒精灯上迅速过火两次
②先用A液浸没标本,再加等量的B液和液混合,一分钟后倒去染色液,细水冲洗
③加碘液,1-2min后细水冲洗
④加脱色液脱色约半分钟,细水冲洗,
⑤用复染液染约半分钟,细水冲洗,晾干或用吸水纸吸干
革兰氏阳性菌染成紫色,阴性菌染成红色
附:革兰染色液的配置
㈠结晶紫染液
A:结晶紫0.25g研磨后加95%的乙醇2ml,然后在加入蒸馏水98ml
B:碳酸钠1.25g溶于蒸馏水100ml
㈡革兰碘液
氢氧化钠1.0g溶于2.5ml蒸馏水中,加碘2.0g和碘化钾4.0g,再加蒸馏水至100ml,边加边搅,使之均匀混合,保存于棕色瓶中
㈢脱色液
丙酮30ml加入95%乙醇70ml,混匀即可
㈣沙黄2.5-3.0加入95%乙醇10ml,溶解后加蒸馏水至100ml
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孩老爹
第6楼2013/08/25
革兰染色的实验步骤 1。 涂片:左手持菌液试管,右手持接种环,用接种环从试管培养液中取一环菌,从酒精灯外焰穿过,于载玻片中央涂成薄层(事先在背面做好标记圆圈)即可,或先滴一小滴无菌水于载玻片中央,用接种环从斜面上挑出少许,与载玻片上的水滴混合均匀,涂成一薄层。 拔或塞试管塞时,应将试管口通过火焰略加烧灼,最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。 2。 干燥:涂片后在室温下自然干燥,也可在酒精灯上略加温,使之迅速干燥,但勿靠近火焰。 3。 固定:常用高温进行固定。即手持载玻片一端,标本面朝上,在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次,共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃,以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜,放置待冷后染色。 4. 染色: (1)初染: 加草酸铵结晶紫一滴,约一分钟,水洗。 (2)媒染: 滴加碘液冲去残水,并覆盖约一分钟,水洗。 (3)脱色: 将载玻片上的水甩净,并衬以白背景,用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止,约20—30秒,立即用水冲净酒精。 (4)复染: 用番红液染1—2分钟,水洗。 5. 镜检: 干燥后,置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准,过于密集的细菌,常常呈假阳性。 6. 同法在一载玻片上以大肠杆菌于枯草芽孢杆菌混合制片,作革兰氏染色对比。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度,如脱色过度,则阳性菌可被误染为阴性菌;而脱色不够时,阴性菌可被误染为阳性菌。此外,菌龄也影响染色结果,如阳性菌培养时间过长,或已死亡及部分菌自行溶解了,都常呈阴性反应