超高压高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定花粉中的12种生物毒素
摘要：用正己烷饱和的乙腈溶液提取花粉中12种生物毒素，加入乙腈饱和-正己烷溶液去除色素和油脂干扰，旋蒸后用乙腈-水溶液（4+1）溶解固相萃取柱净化分离，UPLC/ESI-MS进行检测。在线性关系内，r＞0.9991，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2定量限（LOQ）为0.5 μg/kg，赭曲霉毒素、伏马毒素B1定量限（LOQ）为100 μg/kg，玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮的定量限（LOQ）均为0.5 μg/kg，回收率77.0%～127%，重复性相对标准偏差（RSDr）小于9.9%，再现性相对标准偏差（RSDR）小于16.9%。方法有良好的精密度和重现性，适用于花粉的检测。
关键词：花粉，生物素，超高压液相质谱
中图分类号：O 658文献标识码；
High performance liquid chromatography - electrospray tandem mass spectrometry method for the determination of 12 kinds of biological toxins in pollen
Abstract:Extraction of 12 kinds of biological toxins in pollen n-hexane saturated with acetonitrile solution, adding acetonitrile saturated solution in hexane to remove pigment and lipid. Using acetonitrile and water (4+1) dissolved solid phase extraction column purification separation after rotary evaporation.Detection was performed by UPLC/ESI-MS is greater than 0.9991 in Online relationships.The quantitation limit of aflatoxins B1、aflatoxins B2、aflatoxins G1、aflatoxins G2 were 0.5 μg/kg，and the quantitation limit of Ochratoxin A、fumonisin B1 were 100 μg/kg . The quantitation limit of Zearalenone、α-Zeranol、β-Zeranol、β-Zearalenol enol、α-Zearalenol enol、Zearalanone were 0.5 μg/kg.The average recovery is 77.0%～127%.Repeatability relative standard deviation is less than 9.9% ,reproducibility relative standard deviation (RSDR) of less than 16.9%. The method is suitable for detection of pollen and has good precision and reproducibility.
Key words：Pollen，Biological Toxin，UPLC/ESI-MS；
花粉、蜂王浆、蜂蜜含有种类齐全的营养素、具有很高的营养保健作用。污染花粉[1]的主要真菌毒素为赭曲霉毒素、伏马菌素毒素、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素、镰刀菌毒素等，研究证实，真菌毒素可以引起人类和动物的急性或慢性中毒[2]。
检测真菌毒素的主要方法有黄曲霉毒素总量（含B1、B2、G1、G2）、赭曲霉毒素A、伏马毒素B1玉米赤霉烯酮及其衍生物的检测方法大多是采用液相色谱法[3，4]、酶联免疫吸附法[5]和近红外光谱[6]等对单个毒素进行分析检测。国外也有利用荧光检测器[7]对包括黄曲霉毒素（B1、B2、G1、G2、M1）和赭曲霉毒素A以及对伏马毒素等的研究；还有利用LC-MS/MS对几十种真菌毒素及其代谢产物的同时检测的报道[8-10]，但是专门针对花粉的研究不多，不适合于进行日常的检测。针对日趋严谨的检验检疫要求和真菌毒素普遍存在于蜂产品中的实际情况，目前，我国还没有专门进行多残留同时测定的方法，故此进行了本实验研究。
1 试剂与仪器
1.1 主要试剂
黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2（aflatoxins B1、aflatoxins B2、aflatoxins G1、aflatoxins G2）和赭曲霉毒素(Ochratoxin A)、伏马毒素B1（fumonisin B1）、玉米赤霉烯酮(Zearalenone)、α-玉米赤霉醇(α-Zeranol)、β-玉米赤霉醇(β-Zeranol)、β-玉米赤霉烯醇(β-Zearalenol enol)、α-玉米赤霉烯醇(α-Zearalenol enol)、玉米赤霉酮(Zearalanone)购置于fermentek公司。
单标标准储备液：分别称量（量取）适量毒素标准品，用乙腈溶解并配成浓度为0.1 mg/mL的标准储备溶液，于2℃～8℃下保存。
基质混合标准工作液：用单标标准储备液适量配置标准工作液，用基质浓度约100 mg/ml的空白基质溶液定容。
净化住M260、O130、F120购于美国泰乐琪公司；
1.2 仪器
1.2.1液相色谱条件
美国AB公司5500型超高效液相色谱-质谱联用仪，配有电喷雾电离源(ESI)。
色谱柱：ACQUITY UPLC R BEHC18，100 mm×2.1 mm，1.7 μm；
进样量：10 µL；流速：0.3 mL/min；柱温：20ºC；
流动相：A：乙腈；B：0.1 mol/L甲酸铵溶液。
梯度：0.70 min, A:5.0%,B:95.0%；3.30 min, A:10.0%,B:90.0%；3.50 min, A:80%,B:20.0%；5.00 min, A:5.0%,B:95.0%。
1.2.2 质谱条件
扫描方式：（±）离子扫描；检测方式：多反应检测；
电喷雾电压：5 500 V；定量离子对（见表1-1）。
2 样品的制备
在2 g样品中依次加入正己烷饱和-乙腈溶液20 ml和乙腈饱和-正己烷溶液5 ml，振荡20 min，10000 rpm离心10 min；吸弃上层正己烷层（重复该步骤至肉眼看不到明显的油脂或色素）后，准确吸取下层的乙腈溶液16 ml于鸡心瓶中，在50℃水浴中旋转浓缩至近干；
加入16 ml乙腈-水溶液（4+1），超生波助溶；将样液注入不同的净化柱中(黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2使用TC-M160净化柱，赭曲霉毒素OA使用TC-O 130净化柱，伏马毒素B1、玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉醇 、β-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮使用TC-F 120净化柱），待其自然流出并分别收集滤出液各1.25 ml于玻璃管中，在50℃水浴中氮吹至近干；
加入1 ml乙腈-水溶液（1+4），超声波助溶，过0.22 μm微孔滤膜，滤出液备测。
用不含被测物的样品按照相同操作，提取空白基质溶液。按照该法提取的空白基质溶液，每毫升相当于含有0.1 g基质物质。
3 结果与讨论
3.1 基质匹配标准曲线、检出限和定量限
在相当于1 g样品含量的基质溶液中，加入不同含量的标准溶液，配置成基质标准溶液系列工作液。在仪器和样品处理选定的条件下，用测定各被测物对应的峰面积，建立线性方程。其被测定物基质匹配线性方程、线性范围和相关系数见表3-1。
3.2 正确度与重复性精密度
3.2.1正确度验证
同一样品分为三个水平测定（每个水平分别添加1.0、1.5和2倍定量限被测物），每个水平重复测定6次。计算平均回收率，并由计算每水平6个测试结果的变异系数CV。数据见表3-3。
3.2.2重复性精密度验证
同一样品分为二个重复性测定组（一组、二组），每个重复性测定组分为三个水平测定（每个水平分别添加1.0、1.5和2倍定量限被测物），每个水平重复测定6次。
计算平均回收率和相对标准偏差RSDr。数据见表3-2。
3个水平花粉样品的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、赭曲霉毒素、伏马毒素B1、玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉酮的不同实验室验证结果，按照GB/T 6379《测试方法的精密度 通过实验室间试验确定标准测试方法的重复性和再现性》进行实验室间重复性精密度和实验室间再现性精密度数据统计，经过科克伦检验、曼德尔检验、格拉布斯检验没有发现数据离群和异常；重复性拟合时，一次线性较好；再现性拟合时，一次线性很好。6个实验室间回收率在77.0%～127%之间，重复性相对标准偏差（RSDr）小于9.9%，再现性相对标准偏差（RSDR）小于16.9%，均符合实验室内与实验室间重复性相对标准偏差和再现性相对标准偏差之要求。
4 结论
本实验建立了一种灵敏、准确的用多种真菌毒素净化柱，以UPLC/ESI-MS方式同时测定花粉中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和赭曲霉毒素、伏马毒素B1、玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮等12种真菌毒素的方法。该方法所涉及的相关真菌毒素的测试水平的回收率和重现性指标符合SN/T0001的要求。所建立的LOD值满足欧盟对上述毒素已规定或正在制定的最大允许水平，方法的技术指标满足国内外对上述真菌毒素检测的有关要求。
参考文献
[1]王开发．花粉药用研究进展综述[J]．世界科学技术-中药现代化，2000，2(2)：51-56.
[2]黄天培，何佩茹，潘洁茹，关雄.食品常见真菌毒素的危害及其防止措施[J]．生物安全学报，2011，20(2)：108-112.
[3]尹珺.脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）检测方法的研究[D]．南京：南京农业大学，2006，38-66.
[4]许烨，马荣山，李军.高效液相色谱法测定酒中的赭曲霉毒素A[J]．酿酒，2006，33（2）：40-42.
[5]田禾箐，刘秀梅.粮食中杂色曲霉素酶联免疫吸附测定方法[J]．卫生研究，2004，33（1）：111.
[6]许庆方，韩建国，玉柱，岳文斌.近红外光谱技术(NIRS)在检测牧草霉菌毒素中的应用[J]．光谱学与光谱分析，2010，30（5）：1243-1247.
[7]韩惠雯，黄菲菲.免疫亲和柱——高效液相色谱法测定肾脏中的赭曲霉毒素A[J]．中国食品卫生杂志，2009，21（3）：250-252.
[8]曹晓琴.动物源食品和饲料中三类真菌毒素定量/确证方法研究[D]．武汉：华中农业大学，2010.
[9]汪世华，张峰，袁军，张薇，刘晓雷，王磊.生物毒素检测技术新进展[J]．应用于环境生物学报，2008，14:5726-731.
[10]宫小明，任一平，董静，孙军，李建，金超，于金玲.超高效液相色谱串联质谱法测定花生、粮油中18种真菌毒素[J]．分析测试学报，2011，30（1）：6-12.
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