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新疆特有种无腺毛甘草中黄酮类化合物消长规律的研究

wakinqian

2013/10/02
光谱

私聊

分离/萃取

[摘要]本实验分别提取两年生、三年生无腺毛甘草主根、侧根、水平根及茎中的黄酮，并测定其含量，初步找出消长规律。以甲醇为提取溶剂，索氏提取法提取黄酮，分光光度法测定总黄酮含量。结果表明两年生无腺毛中主根、侧根、水平根及茎中的黄酮含量分别为1.28%、1.28%、1.56%、0.73%；三年生无腺毛中主根、侧根、水平根及茎中的黄酮含量分别为1.75%、1.46%、1.81%、0.41%。随着年限的增大，无腺毛甘草中根部的黄酮含量逐渐增大。同龄期无腺毛甘草中黄酮含量：水平根最高，主根和侧根次之，茎最小。

[关键词] 无腺毛甘草黄酮含量测定消长规律

1.前言

无腺毛甘草（Glycyrrhiza eglandulosa X.Y.Li）[1，2]是石河子大学李学禹教授在新疆发现、1993年命名的新种，也是我国的特有种。它生长的环境条件比乌拉尔甘草（G. uralensis）更恶劣，因而更加耐干旱、耐盐碱，而且是很适合于低产地、弃耕地等恶劣环境条件下生长的抗逆性极强的甘草物种。这个种在形态分类系统学、细胞学、生态学都有研究，根据细胞染色体组型分析与形态数值分析，都证实它与乌拉尔甘草、光果甘草亲缘关系较近[3-5]，但在化学成分方面未进行系统研究。根据资料报导，产于新疆的胀果甘草(G.inflata)、黄甘草(G.eurycarpa)及云南的云南甘草(G.yunnanensis)都发现过大量的具有生理活性的新的化学成分[6-14]。由此可知：一个形态性状特异、分布于逆境条件下能正常生长的新物种，肯定具有抗逆性较强的基因所决定的代谢产物，肯定有特殊性。为此，我们拟从应用开发的角度，提取无腺毛甘草中黄酮类化合物，对其进行含量测定，并进一步研究其在不同龄期、不同部位黄酮类化合物的消长规律，为进一步研究其化学组成和结构打下基础，并且为退耕还草大面积栽培无腺毛甘草提供科学依据。

2.实验部分

2.1实验仪器、样品与试剂

2.1.1实验仪器：

紫外可见分光光度计（上海棱光技术有限公司），索氏提取器（自治区化玻站提供），烘干箱（湖北省黄石医疗器材厂），电光分析天平（上海棱光技术有限公司），精密PH计(上海雷磁仪器厂)。

2.1.2实验样品：

两年生、三年生的无腺毛甘草（石河子大学甘草栽培基地李学禹教授提供）。

2.1.3实验试剂：

柚皮苷对照品（中国药品生物制品检定所），10%的氢氧化钾溶液，甲醇(AR)。

2.2黄酮类化合物的提取

分别称取3份两年生无腺毛甘草的主根粉碎后放入索氏提取器中，加入甲醇回流2h,冷却后分别将回流液转移至容量瓶中，提取两次，提取液合并，用甲醇定容。

用同样的方法分别提取两年生无腺毛甘草的水平根、侧根和茎以及三年生无腺毛甘草中主根、侧根、水平根、茎中的黄酮。

2.3黄酮类化合物的含量测定

2.3.1对照品溶液的制备

准确称取柚皮苷对照品适量，用甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，制得浓度约为1.0mg.mL-1的对照品溶液。

2.3.2最大吸收峰的确定

精确吸取柚皮苷对照品溶液0.5ml，加入5ml甲醇，再加入10%KOH溶液2.5ml，室温放置5min，用甲醇稀释至50ml，用甲醇做空白对照，于200nm～600nm波长处扫描，结果在415nm处有最大吸收(图1)。

精密吸取提取液2ml，加10%KOH溶液2.5ml，室温放置5min，用甲醇稀释至50ml。另取提取液2ml，直接用甲醇稀释至50ml，作为空白对照，于200nm～600nm波长处扫描，结果在417nm处有最大吸收（图2）。

2.3.3 标准曲线的绘制

精确吸取柚皮苷对照品溶液分别配成不同浓度梯度，在415nm处测定其吸收值。以吸光度A为纵坐标，对照品的量(mg)为横坐标，做工作曲线（图3），浓度对吸光度的标准曲线回归方程为：

Y=40.115x－0.0043，R2=0.9997

图3 柚皮苷标准曲线

2.3.4重复性试验

准确移取两年生无腺毛甘草侧根提取液6份，加入甲醇及KOH溶液，室温放置5min，用甲醇定容至25mL。再取上述样品溶液直接用甲醇定容至25 mL，作为空白对照,，于417nm处测定（表1）。测得无腺毛甘草侧根中黄酮平均含量为1.287%，RSD=0.74%。

表1 重复性试验结果（n=6）

编号

RSD%

吸光度A

黄酮含量%

0.249

1.297

0.247

1.286

0.247

1.286

0.249

1.297

0.244

1.271

0.247

1.286

0.74

从表1结果可以看出，用紫外分光光度法测定无腺毛甘草侧根中黄酮含量,结果相对标准偏差较小，实验结果重复性好，所得数据精确。

2.3.5稳定性试验

精密移取侧根供试液，按标准曲线项方法操作，于1h，2h，3h，4h，5h，6h，7h，8h分别测其吸收度。结果见表2，RSD=0.48 %。

表2 稳定性实验结果

时间	1	2	3	4	5	6	7	8	RSD
吸光度	0.249	0.250	0.251	0.249	0.248	0.247	0.249	0.250	0.48%

结果表明本法测定黄酮，在8h内稳定,稳定性较好。

2.3.6加样回收率试验

分别取两年生无腺毛甘草中茎的提取液5份，分别加入一定量的柚皮标准品，按上述操作方法进行，测定吸光度值，得出总黄酮含量，根据回收率公式计算出加样回收率，结果见表3。结果平均为98.61％，RSD为0.32％。

表3 加样回收率实验结果

编号

浓度mg/ml

加入质量mg

回收率%

0.007448

0.0971

98.45

0.007473

0.0971

99.09

0.007448

0.0971

98.45

0.007448

0.0971

98.45

0.007473

0.0971

99.09

从结果可以看出，以柚皮苷标准品为对照品，分光光度法测定提取液中总黄酮含量，加样回收率为98.61%,相对标准偏差为0.32％。回收率较高，偏差较小，所以本方法准确度较高。

2.3.7黄酮含量的测定

分别移取一定量提取液至25ml容量瓶中，加入KOH溶液和甲醇，显色5min,用甲醇定容，按标准曲线操作进行，测吸光度值，由标准曲线计算出黄酮含量，结果见表4、表5

表4 两年生无腺毛甘草不同部位黄酮含量测定结果

编号	甘草质量（g）	吸光度A	总黄酮质量（mg）	含量 %
水平根	0.2431	0.300	3.79	1.56
	0.2430	0.300	3.79
	0.2431	0.301	3.81
主根	0.2343	0.239	3.03	1.28
	0.2342	0.235	2.98
	0.2342	0.235	2.98
侧根	0.2434	0.246	3.12	1.28
	0.2435	0.247	3.13
	0.2434	0.247	3.13
茎	0.2416	0.137	1.76	0.73
	0.2418	0.139	1.79
	0.2418	0.139	1.79

表5 三年生无腺毛甘草不同部位黄酮含量

编号	甘草质量（g）	吸光度A	总黄酮质量（mg）	含量 %
水平根	0.2506	0.360	4.54	1.81
	0.2505	0.357	4.50
	0.2506	0.361	4.55
主根	0.2503	0.348	4.39	1.75
	0.2502	0.350	4.44
	0.2505	0.349	4.40
侧根	0.2503	0.291	3.68	1.46
	0.2503	0.290	3.67
	0.2509	0.286	3.62
茎	0.2507	0.081	1.06	0.41
	0.2507	0.080	1.05
	0.2507	0.076	1.00

2.4结论

在试验生长年度内，无腺毛甘草中根部的黄酮含量与生长年限呈正相关。随着生长年限的增加，黄酮的含量逐渐增长，且相应各龄期无腺毛甘草侧根、主根、水平根中黄酮的含量也成上升趋势（图4）。

无论是二年生甘草还是三年生甘草，其主根、侧根、水平根及茎中黄酮的含量都呈一定的规律性，即水平根黄酮含量最高，其次为主根，再次为侧根，最低为茎。如图4所示。

参考文献

[1] 李学禹.甘草属新分类系统与新分类群.植物研究，1993，13（1）：14-47

[2] 中国科学院中国植物志编辑委员会，中国植物志，1998，42（2）:169—170，

[3] 李学禹，魏凌基.中国甘草属植物的核型分析.植物研究，1991，11（3）：45—53

[4] 张富民，李学禹.中国甘草属植物的形态变异与生态环境的关系.新疆环境保护，1997，19（1）：32—37

[5] 刘伯衡，李学禹，田丽萍,等.新疆产甘草主要化学成分消长规律的研究.干旱研究，1992，9（1）：39—46

[6] 刘勤，刘永隆.黄甘草化学成分的研究.药学学报，1989，24（7）:525—531

[7] 蔡立宁，张如意，张志亮,等.黄甘草皂甙的结构.药学学报，1991，26（6）：447—450

[8] 胡金锋，叶仲林，沈风嘉.云南甘草中新三萜成分的研究.药学学报，1995，30（1）：27—33

[9] 徐任生，文广铃，江树发，王长根.甘草查耳酮的分离、结构与全合成.化学学报，1979，37（4）：289—295

[10] 杨世林、刘永隆.胀果甘草化学成分.植物学报，1989，30（2）：176—182

[11] 赵玉英，张如意，刘鸣.胀果甘草化学成分研究（I）.北京医科大学学报，1990，22（4）：283—286

[12] 蔡立宁，张如意，曹国颖.黄甘草化学成分的研究（I）.北京医科大学学报，1989，21（1）：64—65

[13] 张聿梅，许旭东，胡碧煌，刘勤,等.黄甘草异黄酮成分的研究.药学学报，1997，32（4）：301—304

[14] 王邠，邹坤，杨宪斌，贺文义,等.胀果甘草中2个新的二氢黄酮甙.药学学报，1997，32（3）：199—202

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