五个小窍门提高HPLC反相液相色谱柱的使用寿命

五个小窍门提高HPLC反相液相色谱柱的使用寿命

高效液相色谱（HPLC）是20世纪60年代发展的一种色谱分析手段，现如今已成为分离测定的重要方法，广泛运用于制药、食品、环境、石油及生物等几乎所有研究领域，色谱柱作为该系统的核心，分离效果的好坏取决于色谱柱的状态，养成良好的使用习惯，提高色谱柱的寿命至关重要。

下面小编就以反相色谱柱为例，给大家列出几个小窍门提高色谱柱的使用寿命。

一、 样品前处理

由于被分析样品种类繁多，加之样品基质复杂，色谱柱极易被污染，是导致柱压升高、分离能力下降的原因之一，通常有下面两种情况。

1、直径大于筛板孔径的颗粒物，堵在柱头筛板上，极易导致柱压高；上样前用针式滤器过滤将很好的解决这个问题，一般有0.22和0.45um规格，根据您的需要选择合适规格的。同时在柱前接上在线过滤器，可过滤流动相携带的颗粒，泵、进样阀磨损流失的颗粒物。

2、吸附性强的小分子很难洗脱下来，多次上样后聚集在柱头，可导致柱效差，柱压高，尤其是食品、生物、环境样品更容易损伤色谱柱，建议用SPE固相萃取去杂，并安装保护柱

二、 养成测柱效的习惯，正确评价色谱柱

每个厂家的色谱柱出厂报告中都会附有一份柱效报告谱图，代表该色谱柱的性能，我们只要留意理论塔板数和拖尾因子即可。当拿到色谱柱后，建议先测柱效（可参照出厂柱效报告上的方法），保留谱图，再做样品。

当使用了一段时间后，或者实验出现问题时，换一台正常的液相仪测柱效，对比上述保留的新柱柱效报告来评价该色谱柱，这样做可以排除液相仪、样品等其它因素，正确的判断色谱柱是否合格。

在修复损坏的色谱柱时，柱效测试将是您判断是否修复好的最佳指标，并且柱效测试流动相很简单，能快速验证。

三、 针对色谱柱适用范围选择合适的流动相

1、PH：常规的硅胶反相色谱柱PH耐受2-8，当PH偏低时会导致键合相断裂，当PH偏高时会溶解硅胶导致柱头塌陷。也有一些宽PH范围的色谱柱应运而生，在选择色谱柱时PH范围一定要与流动相匹配。

2、温度：常规的硅胶反相色谱柱最佳温度20-60度，基本可以满足绝大多数实验，相信温度对于寿命的影响会很小。

3、是否耐100%纯水：常规反相色谱柱有个缺点，100%纯水流动相会引起疏水塌陷，导致不保留样品，现在有很多厂家先后推出可以耐纯水的反相色谱柱，您在选择和使用时一定要留意您的流动相是否合适。

四、 经常冲洗色谱柱及再生

日常清洗：

随着使用时间的增加，色谱柱的污染会逐渐增加，经常的清洗非常关键，尽量每次在保存色谱柱之前都冲洗，一般反相色谱柱冲洗流程：

再生：

说白了，再生是对于色谱柱污染严重的柱子而言，污染主要集中在柱头，分为筛板堵塞和柱头填料污染。

筛板堵塞主要表现为压力升高，建议将筛板拆除于水中超声5-10min，再换到甲醇中超声5-10min，基本能将污染物去除。

柱头填料污染主要表现是峰型变差，柱效降低，非常严重的打开柱头会发现填料颜色由原本的白色变为黄色甚至褐色，如此严重的污染很难再生。污染源多为不可逆吸附或强吸附在反相键合相上的化合物，需要强洗脱溶剂才能冲洗下来，再生的程序如下：

100%甲醇→100%乙腈→75%乙腈+25%异丙醇→100%异丙醇→100%四氢呋喃

低流速，如0.3ml/min，每个环节冲洗20柱体积，清洗后再按照相反的顺序冲洗色谱柱，以返回到原始的流动相。

由于色谱柱污染主要集中在柱头，反接色谱柱按照上述程序冲洗，可以大大加强冲洗效率，但不要接检测器，柱出口直接接废液瓶。

对于蛋白污染、缓冲盐或样品析出污染、金属污染都有各自的再生方法，在此不一一敖述，可参考大目录中的“色谱柱使用注意事项”一章。

五、 合理的保存条件

对于反相硅胶色谱柱，短期可储存在不含缓冲盐的流动相中，比如1-2天；如果长期保存建议储存在出厂储存溶剂中，推荐100%乙腈。