三人行
第3楼2013/11/26
高效液相色谱法测定奶粉中的泛酸
摘要:本文根据国家标准GB 5413.17-2010《婴幼儿食品和乳品中泛酸的测定》,建立了利用我公司高效液相色谱LC-5500 测定奶粉中泛酸的方法:色谱柱:XBP-C18柱;流动相:甲醇(0.05mol/L): KH2PO4=20:80;流速:1ml/min ;进样量:20μL;紫外检测器,波长200nm。柱温:30℃ ± 1℃。方法在1.0 μg/mL 到12.0 μg/mL之间线性良好,线性相关系数r≥0.999,泛酸的回收率在99.1% ~101.0%之间,RSD值≤2.69%。对客户提供的奶粉样品进行检查发现,泛酸含量均符合要求,有的样品中泛酸含量远高于标值。
关键词:LC-500高效液相色谱;泛酸;奶粉
从奶粉的三聚氰胺事件以来,国家对乳制品企业监测的要求越来越严格。2010年底至2011年初,国家质检总局对全国乳制品企业进行了集中检查。根据客户的需求,和相应的国家标准以及我们公司高效液相色谱的特点,对乳制品中允许和不允许加入的添加剂如三聚氰胺、山梨酸、苯甲酸、烟酸、牛磺酸、泛酸等的检测方法进行了优化。
泛酸又名维生素B3,因广泛存在于自然界故被名为泛酸。泛酸是由泛解酸和β-丙氨酸组成的一种化合物。泛酸主要生理功能作用是构成辅酶A和酰基载体蛋白,并通过他们在代谢中发挥作用。我国国标(GB10765,6,7-1997)中规定,婴幼儿配方奶粉中泛酸含量不得低于1500μg/100g(质量比)它是乳及乳制品中的重要的营养素之一。
1 实验材料与方法
1.1主要仪器
1.1.1 LC500高效液相色谱仪(HPLC):配有紫外检测器(杭州旭昱科技有限公司)。
1.1.2 分析天平:感量为0.0001g(赛多利斯)。
1.1.3 超声波水浴(AS3120)。
1.1.4 pH计:精度为0.01。
1.1.5 滤膜:0.45μm。
仪器配置:
1.2 试剂
1.2.1甲醇:色谱纯。
1.2.2 盐酸:分析纯。
1.2.3 硫酸锌:分析纯。
1.2.4 盐酸(0.1mo1/L):移取8.3mL盐酸于1000mL容量瓶中,用水定容。
1.2.5 硫酸锌溶液(15g/100mL):称取15g硫酸锌用水溶解并定容至100mL。
1.2.6 磷酸二氢钾溶液(0.05mo1/L):称取6.8g磷酸二氢钾,用水溶解并定容至1000mL。
用磷酸调节pH值至3.0,用0.45μm滤膜过滤。
1.2.7 泛酸标准储备溶液(1mg/mL):准确称取泛酸钙1.087g,加水溶解并定容至1000mL。
(泛酸浓度=泛酸钙浓度X0.920)
1.2.8 泛酸标准中间液(0.1mg/mL):吸取标准储备液5mL于50mL 容量瓶中,加水定容。
临用前配制。
1.2.9 泛酸标准的工作液的配制:分别准确吸取泛酸标准中间液1.0mL,2.0mL,4.0mL,8.0mL,12.0mL于100mL容量瓶中,加水定容至刻度,得到浓度分别为1.0μg/mL,2.0μg/mL,4.0μg/mL,8.0μg/mL,12.0μg/mL的泛酸标准工作液,临用前配制。
1.3 色谱条件
色谱柱:C18反相色谱柱(粒径5μm,250mmx4.6mm)。
流动相:取磷酸二氢钾溶液800mL,取甲醇200mL,混均后0.45μm微孔滤膜过滤。
流速:1.0mL/min。
检测波长:200nm。
柱温:30℃ ± 1℃。
进样量:20μL。
1.4 测定方法
1.4.1 样品处理
称取混合均匀的固态试样5g(精确至0.0001g)或液态试样约20g(精确至0.0001g)于150mL三角瓶中,固体试样加入约30 mL40 ℃~50 ℃温水,振摇溶解后超声萃取20min。(若样品中含有淀粉,称取样品后加入淀粉酶约0.2g,固体试样加入约30 mL 40 ℃ ~ 50 ℃温水振摇溶解,盖上瓶塞,在50 ℃~60 ℃条件下酶解30min。)
1.4.2 测定液的制备
试样溶液降至室温后,用0.1mo1盐酸调节pH至4.5±0.1,加入5mL硫酸锌溶液,充分混合。转入100mL容量瓶中,用水定容至刻度并充分混均后,用滤纸过滤。滤液经0.45μm
滤膜过滤后即为试样待测液。
1.4.3 测定
仪器条件设置好后,进标准溶液,根据峰高与浓度绘制标准曲线,根据保留时间定性,用外标法定量。
2 结果与讨论
2.1 流动相对样品分离结果的影响
采用了有关资料中介绍的流动相,V(甲醇):V(KH2PO4)为1:9进行试样。结果证明,虽然在此条件下标准峰型比较好,但保留时间较长,并且样品中泛酸的吸收峰无法与样品中其他组分有效分离,说明在该配比的流动相不能用于测定乳制品中的泛酸。
2.3 回收率的测定
按照试验确定的方法,对检测方法进行了回收率的测定,结果如下表。有表一可知,泛酸的回收率在99.1% ~ 101.0%之间,说明在样品处理和测定过程中,泛酸的损失很小,检测方法可以应用于奶粉中泛酸钙的测定。
表一 泛酸回收率实验结果
样品 加标量(mg) 理论值(mg) 实测值(mg) 回收率(%)
加标1 0.20 0.57 0.573 100.5
加标2 0.40 0.77 0.778 101.0
加标3 0.80 1.17 1.159 99.1
2.4 精密度实验
称取4份样品,处理后分别进行测定,结果见表二。有表二可以看出,本方法测定乳制品中的泛酸具有较好的重现性,RSD值≤2.69%。并且由所得到的数据可知,所测定的客户提供的奶粉中泛酸的含量均符合要求,并且有的产品中泛酸含量远高于标示值。
表二 泛酸密度试验
测定次数 1 2 3 4 平均值 RSD(%)
泛酸含量(mg/100g) 5.03 4.92 4.67 4.85 4.87 2.69
3 结论
经试验得知,LC-500分析奶粉中泛酸的含量,流动相的比例V(甲醇):V(KH2PO4)为2:8时,泛酸的保留时间合适,在6.8min左右,并且样品中泛酸峰与样品中其他组分能够有效的分离,且无溶剂峰飞干扰,在此条件下科满足测定乳制品中泛酸的含量要求。此方法在1.0μg/mL到12.0μg/mL之间线性良好,线性相关系数r=0.99977。此方法泛酸回收率与精密度实验结果较好,回收率在99.1% ~ 101.0%之间,RSD值≤ 2.69%。
综上所述,采用LC-500HPLC法测定乳制品中泛酸含量的方法是一较理想的方法。该法操作简便,易于掌握,因此可作为常规检测方法应用。本方法对客户提供的奶粉进行了测定,结果显示,奶粉中泛酸的含量均符合要求,并且有的奶粉中泛酸含量明显高于标示值。