超高效液相色谱检测奶及奶制品中的M族黄曲霉毒素-增补版

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2014/02/07

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超高效液相色谱检测奶及奶制品中的M族黄曲霉毒素

液相色谱条件

液相色谱仪：美国Waters Acquity超高效液相色谱仪配荧光检测器（带大体积流通池）

色谱柱：Welch Ultimate XB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流速：0.3 mL/min ；柱温：40 ℃；进样量：10 μL；激发波长：360 nm；发射波长：420 nm；流动相： A：纯水；B：甲醇/乙腈（50+50）；梯度条件：0~4.0 min，30%B；4.2~4.7 min，100%B；5 min，30%B。

样品提取与净化

液态奶样品, 称取10.0 g于50 mL离心管中, 加入25mL乙腈, 充分涡旋3 min后, 超声提取10 min, 8000r/min条件下离心5min, 取全部上清液旋蒸至10 mL以下, 全部转移至50 mL容量瓶中, 以PBS溶液定容至刻度。取25mL溶液过黄曲霉毒素M₁免疫亲和柱, 以10mL PBS缓冲液淋洗柱子, 弃去全部流出液, 用5 mL甲醇洗脱免疫亲和柱, 收集全部洗脱液于玻璃试管中, 55 ℃下氮吹干, 用1.0 mL乙腈:水(20:80)溶液溶解残留物, 过0.22 μm滤膜, 收集滤液于进样瓶中, 供上机检测。过柱净化处理在自动固相萃取装置上进行。
奶粉样品, 称取1.00 g样品, 加入10 mL水溶解。其余过程同液态奶样品。

波长选择

采用流动相作为背景溶液, 分别扫描黄曲霉毒素M₁、M₂的激发波长和发射波长(图2, 图3)。固定发射波长420nm, 激发波长从300 nm扫描到400 nm; 固定激发波长360 nm, 发射波长从390nm扫描到500 nm。结果表明黄曲霉毒素M₁、M₂的最佳激发波长为360nm, 最佳发射波长分别为420 nm和426 nm。黄曲霉毒素M₁、M₂的结构很相似, 因此波长也相差不多。考虑到简化检测条件, 因此取激发波长为360nm, 发射波长为420 nm。

线性范围与检出限

以0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 ng/mL的黄曲霉毒素M₁、M₂混合标准溶液作校准曲线, 在给定条件下进行UPLC分析, 以峰面积为Y轴, 浓度为X轴做校准曲线。

分别取空白基质样品, 加入混合标准溶液, 经放置待加入的标准品与基质充分混合后, 按方法前处理, 根据3倍信噪比的峰响应值, 得出此方法检出限, 根据10倍信噪比, 得出线性范围的下限。结果见表1。

加标回收及精密度

实验中所用的免疫亲和柱为黄曲霉毒素M₁免疫亲和柱, 为了验证该柱对黄曲霉毒素M₂的适用性, 以稀释后的标准溶液过黄曲霉毒素M₁免疫亲和柱, 3个平行, 回收率见表4。平均回收率均大于80%。
向空白牛奶样品中添加不同量的黄曲霉毒素M₁、M₂混合标准溶液, 每个添加量做3个平行, 计算黄曲霉毒素M₁、M₂的平均回收率及相对标准偏差, 结果见表2。取中等水平的添加样品做精密度(n=5)试验, 液态乳中黄曲霉毒素M₁、M₂的日内精密度(RSD)分别为2.7%、4.8%,乳粉中黄曲霉毒素M₁、M₂的日内精密度(RSD)分别为2.1%、4.5%。

实际样品测定

实验中对市售的50份牛奶及奶粉样品进行了检测, 其中黄曲霉毒素M₁的检出率为80%, 发现奶粉超标样品2份。黄曲霉毒素M₁的含量分别为 0.88 μg/kg和0.79μg/kg; 同时, 发现这两份奶粉样品同时含有黄曲霉毒素M₂,含量分别为0.22 μg/kg和0.20μg/kg。阳性样品谱图见图3。

表1 黄曲霉毒素M₁、M₂检测方法的线性回归方程及相关系数

样品基质	添加量(μg/kg)	毒素种类	平均检测结果(μg/kg)	RSD/%	平均回收率(%)
溶剂	10.00	AFT M₁	8.150	3.9	81.5
溶剂	10.00	AFT M₂	9.890	2.5	98.9
液态奶	0.05	AFT M₁	0.502	2.0	100.4
	0.05	AFT M₂	0.532	3.7	106.4
	0.20	AFT M₁	0.175	3.2	87.5
	0.20	AFT M₂	0.172	2.2	86.0
	1.00	AFT M₁	0.845	1.8	84.5
	1.00	AFT M₂	0.856	2.4	85.6
奶粉	0.50	AFT M₁	0.418	4.6	83.6
	0.50	AFT M₂	0.426	3.7	85.2
	2.00	AFT M₁	1.750	1.4	87.5
	2.00	AFT M₂	1.630	2.0	81.5
	10.00	AFT M₁	8.560	2.3	85.6
	10.00	AFT M₂	9.340	3.4	93.4