【资料】电喷雾电离质谱及其在蛋白质化学研究中的应用

3．电喷雾电离质谱用于多肽与蛋白质分析

质谱用于分析生物活性分子的研究，灵敏度高，并能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定。因此它已经成为解决生命科学中分析研究的重要手段。随着电喷雾电离技术的广泛应用，多肽与蛋白质分析近年来取得了相当大的成功[2~5]。

ESI-MS可分为正离了ESI-MS和负离子ESI-MS，一般而言，多肽与蛋白质的ESI-MS分析总是以正离子方式进行，这是因为蛋白质中含有较多的碱性氨基酸（Arg,Lys和NH2端）具有足够大的离解常数以确保蛋白质在酸性溶液中最可能地多重质子化。而负离子ESI-MS一般用于分析拥有酸性官能团（诸如羧基、磷酸基等）的分子如核苷酸。负离子ESI-MS以（M-nH）n-的电荷形式出现，通常比正离子ESI-MS的灵敏度低，灵敏度的下降是由于Na+代替了H+的原故，当核苷酸分子量增加时，磷酯钠加合物也同时增加。这个结果使峰加宽，灵敏度下降。

大多数蛋白质的ESI-MS的一个特点是平均电荷状态随分子量的增加而呈近似的线性关系。对蛋白质而言，被检测到的最大荷电状态与碱性氨基酸肽段数目加上-NH2端也成近似的线性关系。含有丰富二硫键的蛋白质比那些没有形成二硫键的分子量较小的分子得到的电荷少，可能的原因是在这些蛋白质中交叉连接的肽链不可能完全展开的原因。ESI-MS的主要缺陷是不易处理复杂混和物，因为它们产生一系列复杂的多电荷离子不易分辨。以下是ESI-MS在蛋白质化学研究中的一些应用。

3.1分子质量的检测

蛋白质的分子质量是一个重要的参数，而目前常用于测定蛋白质分子量的方法，如凝胶电泳或超速离心法，只有5%的精度，使蛋白质分子质量的估计不可靠。ESI-MS中所形成的多电荷离子可以直接用来准确地和高灵敏度地确定多肽与蛋白质的分子量。因为ESI-MS不仅可与四极质谱相连，它还能与磁质谱、离子阱、飞行时间质谱及付里叶变换回旋共振仪相连，在pmol数量极的水平或更少的样品检测中当分辩率1000时可达到0.005%的精度[6]，降低分辩力，对于肽在四极质谱上的检测限可到30fmol，Green等（7）用电喷雾电离-付里叶变换回旋共振质谱仪测定了质量相差很小的蛋白质。当样品量非常少时，在实验中样品的处理成为一个限制因素，这时电喷雾质谱可与液相色谱和毛细管电泳相连来发挥它的优越性。另外由于ESI-MS可以产生多电荷峰使检测的分子质量范围大大扩大，使M/Z限制在一定范围的四极质谱，就可以获得分子量超过200ku的蛋白质，但是，虽然它可检测分子质量超过100ku的分子，但是分析非常复杂，这是因为此时的蛋白质的多电荷峰非常复杂，难以分辨，这可能是ESI-MS不能很好地分析复杂糖蛋白的主要原因，因为糖部分的不均一性能产生大量的重叠峰。

3.2肽谱

肽谱是一个蛋白质通过酶解，得到的肽片段被分离和分析所得到的。这种方法很多年来一直用来检测蛋白质的一级序列。现在，肽谱与质谱结合称为质量肽谱。它的用途有：（1）确定蛋白质序列，尤其是重组DNA技术生产的蛋白质。这个过程是将胰酶酶解后的肽的分子质量与由从理论计算得到的分子质量相比较。在ESI-MS和MALDI-MS出现以前，序列测定是很复杂的过程，需要HPLC条件的优化，分离所有酶解碎片，通过氨基酸分析，肽序列分析几步来分析所有碎片。这需要很长时间，而现在随着ESI-MS和MALDI-MS及MS-MS的出现，这些过程只需要相当短的时间。Loo等（8）和Owens等（9）用ESI电离技术进行了肽的序列分析；（2）确定和鉴别翻译后的修饰。大多数蛋白质在生物合成后都要进行翻译后修饰，在许多情况下翻译后修饰对蛋白质生物活性是至关重要的，目前质谱可能是最好的方法来检测翻译后修饰。Liu 等（ 10）通过毛细管电泳与电喷雾电离串联质谱相连检测了重组修饰后的蛋白质。（3）测定蛋白质降解产物，几乎所有的蛋白质降解产物与原蛋白分子质量上均有变化，质谱从原理上可以检测这种降解产物 ，但是对于Mr超过20ku的大蛋白质，质谱不能提供足够的分辨率来测定只有一个分子质量的变化。因此通常是由肽谱和质谱确定蛋白质的降解产物。将蛋白质酶解后的碎片用ESI-MS可找出与没降解蛋白质碎片的不同，来确证蛋白降解产物；（4）测定蛋白质的代谢产物，Wroblewski等[11]用ESI-MS研究了体外人生长激素的代谢产物和去(64,65)-人胰岛素原的代谢产物； (5)配基结合键，Sall等[12]用肽谱和ESI-MS确定了配基位点。

用现代技术如ESI-MS和MALDI-MS都可在很短的时间内得到蛋白质酶解后的质量肽谱，ESI-MS的优点是在肽谱图中能够得到Mr低于400u的小分子肽段。因此它可以鉴定一些在其他质量肽谱图中不能区分的肽谱。它的另一个特点是能与HPLC系统直接相连来分析酶解后的碎片不需要任何纯化。ESI-MS所产生的多电荷离子特别适用于串联质谱分析，这是因为多电荷离子容易碎裂，使碰撞活化灵敏度提高并且可以选择感兴趣的离子进行碰撞，用来检测目标肽段，可得到完全的序列信息，因此在质量肽谱中应用ESI-MS可提供一种快速证实蛋白质一级结构的方法。

3.3分析肽的合成产物

ESI-MS是一种简单、快速的方法，可用来证实肽的合成产物和确定许多合成副产物[13]，用质量分析（1）确证粗肽混合物中的产品；（2）指导纯化过程；（3）证实最终产物的质量和纯度。四极质谱和离子阱仪器广泛应用为化学家提供了很宽的选择范围。

3.4研究非共价蛋白复合物

由于ESI-MS的温和的电离过程可以使以很弱的非极性共价键相互结合的完整的蛋白复合物直接被检测出来[14]。这些蛋白复合物包括蛋白质与肽的复合物，蛋白质与金属离子的复合物，蛋白质与核酸的复合物以及亚蛋白质结构之间的结合。用ESI-MS分析非共价蛋白复合物具有特殊的灵敏性及快速分析等特点。它在蛋白质/DNA复合物的研究中具有很高的发展前景，通常研究蛋白质/DNA所用的方法是电泳迁移率变动分析（EMSA），而ESI-MS可以得到由EMSA所不容易获得的更详细的结果。色氨酸抑制子（15）及维它命D受体（16）用ESI-MS分析，得到了其它技术所不能获得的信息。免疫缺陨病毒蛋白质复合物也成功地用ESI-MS进行了测定（17），Ganem等还成功地应用ESI-MS检测了非共价受体-配基复合物.



3.5寡核苷酸的测定

在ESI-MS和MAILD-MS出现以前用快原子轰击质谱和等离子体解吸质谱（PDMS）只能检测到限制在10个碱基以内的寡核苷酸。寡核苷酸的电喷雾质谱是由Covey首次测定的。他在负离子模式下检测了oligomers达到14个碱基。Stults等[18]在电喷雾中应用铵离子代替钠离子，寡核苷酸用含有醋酸铵的乙腈水溶液溶解，被铵盐处理过后，离子检测可达到48个碱基。



3.6蛋白质折叠过程

蛋白质的折叠是包含多肽链的氨基酸序列的信息转换成一个特定的三维结构的过程。这种信息是如何形成具有生物活性的结构知之甚少。现在ESI-MS作为一种新的技术来阐明蛋白质的折叠过程，通过分析电荷状态分布和应用H/D交换技术，ESI-MS被用来展示关于蛋白质的三维结构[19]。最早Chowdbury等提出折叠与非折叠蛋白质可产生不同的电荷分布，他们观察到天然蛋白质的电喷雾质谱含有较低的静电荷，而去折叠蛋白质的电喷雾质谱产生一个较宽毓的电荷峰且带较高的电荷。



4结语

当今社会生命科学蓬勃发展，特别是随着基因组计划的快速、大规模推进，以及蛋白质组概念的出现，使生命科学的研究开辟了一个崭新的研究领域，而以ESI-MS及TOF-MS为代表的现代质谱技术的不断完善与发展，为生命科学研究提供了必要的技术手段。

最新发展的超灵敏度的纳升电喷雾串联质谱技术（nano-ESI-MS-MS）的出现，可在最小的样品消耗量下获得最大灵敏度，灵敏度可高达fmol，已被成功地用于二维凝

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