伏马菌素测定方法应用研究及对粮食污染情况分析

伏马菌素是最近发现的一族主要由几种真菌产生的结构相关的毒素代谢产物，主要包括FB1，FB2和FB3。F1能引起马脑白质软化症，猪肺水肿及大鼠肾及肝癌。美国兽医试验诊断专家联合会毒素委员会推荐马饲料中不得超过5．0mg／kg伏马菌素。流行病学研究显示部分地区食道癌的高发率与玉米中含伏马菌素(1．0-2．0mg／kg)有关。毒物学研究表明少量的FB2和FB3的潜在的致癌作用与FB1类似。国际癌症研究机构与加利福尼亚环境保护机构已宣布伏马菌素为人类潜在的致癌物质。该毒素已被世界卫生组织列为近年来首先进行研究的几种霉菌毒素之一。由于国际上对霉菌毒素研究的发展和国家有关部门提出必须对进口花生、玉米提交霉菌毒素的分析报告公告，卫生部开始将霉菌毒素及其检测技术的研究列入重点科研项目。在检出伏马菌素的玉米混合饲料样品中黄曲霉毒素的检出率为100％，这将推动联合毒性的分析研究。
1材料与方法
1．1材料 液相色谱仪安捷伦HPLC 1200，月旭色谱柱（Ultimate XB-C18 4.6×250mm,5um part number 00201-31043
Serial number 211302350）Fumonisin伏马菌素检测试剂盒，Start Fax 303 Plus Microstrip Reader液晶显示酶标仪。
1．2检验样品来源随机采取市内5个农贸菜市场的50个档位和市外lO个猪场样品共288份，其中玉米36份、玉米混合饲料48份、花生36份、花生酱48份、花生油48份、猪肝24份、鸡肝24份、鸭肝24份。
1．3方法
1．3．1原理 Fumonisin伏马菌素检测应用固相直接竞争酶联免疫吸附原理，用70％甲醇从研磨样品中提取伏马菌素。萃取出的样品液与酶标记的伏马菌素混合加入到抗体包被的微孔中，样品及标准品中的伏马菌素与酶联偶合剂竞争结合孔中的特异抗体。经过洗涤步骤后，当酶的底物被加入到微孔中，颜色变为蓝色，且颜色深浅与样品中伏马菌素含量成反比。加入反应终止液终止反应后．颜色应由蓝色转为黄色。在450nm(OD450)或630nm的滤镜下使用酶标仪对微孔板进行光学测量。将样品与标准品的光密度值进行比较后确定得出的结果。阳性样品提取液应用液相色谱分析法进行确证实验。
1．3．2样品处理及测定取具有代表性的样品，并使用Ro-mer系列U型研磨机，使至少75％的样品能够通过20目筛网，彻底混合并进行二次抽样样品。称取5g研磨样品于干净并可紧密密封的广品瓶中。加入25ml 70／30(v／v)甲醇／水萃取溶液并密封广口瓶中。注意：样品与萃取溶液比例应为1：5(w：v)。震荡或在混合器中混合3min。静置样品。用Welchrom Syringe Filter(Nylon 13mm 0.45um Qty:100 Part Number:00802-02202 Lot Number:140108)过滤萃取上清液，收集待检滤液。注意：样品萃取液的pH值为6—8。PH值过高或过低均会影响检测结果，应在检测前做好调整。测定时，取70％甲醇水样品提取液1份加蒸馏水3份，充分混合，并按试剂盒方法进行测定。
1．4定量范围 检测限：0.2mg／kg；定量限：0．25mg／kg；定量范围：0．25-5.0mg／kg(对于超过5．mg/kg的样品，应将其稀释在定量范围内0.5-5.0mg／kg再做检测)。
1．5结果计算 样品伏马菌素含量(mg／kg或mg／L)=仪器读数×稀释倍数。
1．6液相色谱分析法确证实验取阳性样品的样液，应用液相色谱仪进行确证实验。
2结果
2.1再现性 获得的标准吸收值的变异系数(％CV)对相应伏马菌素浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性(图1)。

2．2回收率ELISA法在不同含量伏马菌素回收率(见表1)

2．3标准曲线图见图2

2．4干扰实验 由于在粮食、饲料中各种霉菌和真菌毒素可能共存，为探索该实验方法的特异性反应情况，通过加入不同浓度的各种霉菌和真菌毒素，进行干扰因素研究。回收率为93.2％一119.0％，见表2。

2．5 ELISA法与液相色谱分析法对照实验 应用ELISA法和液相色谱分析法同时对12份阴性样品和12份阳性样品进行测定，测定结果相符率达100％。

2．6伏马菌素和黄曲霉毒素共同污染状况对照实验 玉米混合饲料中伏马菌素和黄曲霉毒素共同污染状况比较严重，伏马菌素含量在1.93-17.10mg/kg的20份阳性样品，全部同时存在黄曲霉毒素的污染，含量为0.1-91.2ug/kg。

2．7食品样品中伏马菌素和黄曲霉毒素测定结果见表3。

3讨论

联合应用酶联免疫测试盒和液晶显示酶标仪，测定食品和饲料中伏马菌素，在Fumonisin浓度为0.25-5.0(mg/kg)之间％cv为2-8，回收率为92.0％-104.0％，标准曲线的R值为-0.997，其各项检测指标达到满意的结果。用4种常见的霉菌和真菌毒素进行干扰实验，结果显示该方法特异性反应很强。反应结果无干扰现象，回收率为93.2％-119.0％。总之，伏马菌素酶联免疫吸附法和液相色谱分析法被验证有效适用于检测大米、大麦、玉米、生咖啡、高梁、大豆及小麦，是目前检测粮食和饲料中伏马菌素最好的方法。建议日常工作中先用ELISA法快速检测样品，结果为阳性的样品，再选用液相色谱分析法做确证实验。该课题对玉米、玉米混合饲料、花生、花生酱、花生油、猪肝、鸡肝、鸭肝共计288份样品中的伏马菌素、黄曲霉毒素进行分析研究，发现玉米混合饲料中伏马菌素和黄曲霉毒素共同污染比较严重，两种强致癌毒索的共同作用，将更加强其毒害性，在检出伏马菌素的玉米混合饲料样品中黄曲霉毒素的检出率为100％，这将推动联合毒性的分析研究。建议加强玉米混合饲料伏马菌素和黄曲霉毒素的日常检测工作。为了深人了解这种污染可能对动物肝脏的潜在危害性，我们采集24份猪肝、24份鸭肝、24份鸡肝，检测这些样品中伏马菌素和黄曲霉毒素的含量，均未检出。

在测定过程，应将所有试剂回升至室温18-30℃；使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。在使用中不要让微孔干燥。在酶联免疫测定中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是酶联免疫测定程序中的要点。

酶联偶合剂与标准品或样品的比例应保持2：1，但酶联偶合剂与样品量可以减少，例如使用100ul酶联偶合剂，50ul样品或标准品。不能将任何未使用的试剂倒回原装瓶中，检验过程上应分清样品与标准品的位置。且在整个检验过程中，任何时候都不允许摇动微孔板以混合其内溶液。若样品所含伏马菌素浓度高于标准品的最高浓度(>5．Omg／kg)，则需将过滤萃取的溶液再次用70％的甲醇稀释到0.5-5.0mg/kg后．重新检测以得到精确的结果。在最后的结果计算中，注意要将稀释倍数算入。

参考文献：
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[3]江涛，宫慧之，李风琴，等．抗伏马菌素B1单克隆抗体的制备及试剂盒的研制[J]．卫生研究。2006．02．
[4]张笑．侯红漫，刘阳，等．食品中伏马菌素的污染及污染控饲[J]．食品研究与开发．2006．03．
[5]中华人民共和国国家标准，食品卫生检验方法．理化部分.2003

应助达人

还需要做重现性曲线吗

重现曲线吗

怎么字 上面全有 横线啊。

应助达人

怎么字是何意思啊

我看着网页上的 字 就像 人在 字 上面 华了 一横 似的

标准吸收值的变异系数是一个什么概念？

求解释 也不懂这个