液相色谱分析重要指标之一——理论塔板数

液相色谱分析重要指标之一——理论塔板数

理论塔板数是色谱分析中的一个重要参数，它来源于塔板理论。塔板理论是色谱学的基础理论，它是将色谱柱（色谱的核心部件）看作成一个分馏塔，将分离组分（被分离的样品）在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成某种平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，同时形成新的平衡，直至完全被洗脱（移动）出去。

理论塔板数是反应色谱柱性能的主要参数，是表示色谱柱对样品的分离能力或是分离效率（简称柱效），常用“N”表示。通常N值越大，柱效越高，分离能力越强，分离效果就越好。

N取决于色谱柱固定相（填料）的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、柱内径、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果色谱峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为：

理论塔板数=5.54（保留时间/半高峰宽）²，也就是N=5.54（t/w_1/2）²。柱效率用理论塔板数定量的表示：N=16（t/w）²。其中，t是样品保留时间（样品从进样到峰形最高点的时间），单位秒（s），w为峰宽（该样品峰在基线处的宽度），单位厘米（cm）。

不同的色谱柱在同一色谱条件下，理论塔板数大的色谱柱柱效高。N的大小和色谱柱的柱长关系密切，色谱柱越长（塔板数越多），N值越大。

N的大小主要和色谱峰中的两个因数有关，一是保留时间，二是色谱峰宽，保留时间越长N越大，色谱峰宽越窄N越大。要想提高色谱峰的分离效果，增加N值，我们只要从这两个方面做起就足够。一是尽量延长保留时间，二是尽量减小色谱峰宽。延长保留时间方法很多，比如选择更长的色谱柱，降低色谱柱温度，减小流速（这个最好不要变，因为流速减小，色谱峰宽也会变宽，检测灵敏度也会降低，这样可能会得不偿失），适当降低流动相中有机相的含量（主要针对反相色谱）等等。减小色谱峰宽的方法也有很多，比如减小进样量，减小进样器到检测池之间管路的死体积，尤其是缩短连接管路，采用超高效液相色谱，当然采用缩短（和延长保留时间的方法正好相反）保留时间的方法也能减小色谱峰宽，但这样可能对增加N并无帮助。有些方法在改变这两个因数时相互矛盾，我们在具体操作时，可以取利避弊，争取达到最佳效果。

通常我们增加N最常采用的办法就是一是选择更长的色谱柱，二是减小进样量，实际中这两种方法是非常常见的也是非常实用的。

下面我们就用几个具体的实列，简单的说明下。

这是150mm长色谱柱色谱图效果：

这是250mm长色谱柱色谱图效果：

这是20ul进样量色谱图效果：

这是10ul进样量色谱图效果：

增加色谱柱长度和减小进样量对于增加理论塔板数效果还是不错的。对于调节其它色谱条件来改变理论塔板数过程比较复杂，结果可能存在很多不确定性，做起来难度较大，在这我暂不做比较。

另外如果色谱柱的柱效下降了，N值降低到了很低时，我们一般会选择换一根柱效高一些的能满足实验要求的色谱柱。这也是最简单，最实用的方法。但为了减少实验成本，我们不妨试试对色谱柱采用一些再生的方法，如果还不行，那也没遗憾了。

反相色谱柱分别用甲醇:水=10:90,纯甲醇（色谱纯）,异丙醇（色谱纯）,二氯甲烷（色谱纯）等溶剂作为流动相,依次冲洗,每种流动相流经色谱柱不少于30倍色谱柱体积。然后再以相反的次序以不少于30倍色谱柱体积冲洗。

正相色谱柱分别用正己烷（色谱纯）,异丙醇（色谱纯）,二氯甲烷（色谱纯）,甲醇（色谱纯）等溶剂做流动相,顺次冲洗,每种流动相流经色谱柱不少于30倍色谱柱体积。用甲醇冲洗完后,再以相反的次序相同的体积冲洗至正己烷。

注意：对色谱柱再生时使用溶剂的次序不能颠倒；除了甲醇水溶液外，所有的流动相必须严格脱水；流动相必须微膜过滤，并且脱气；再生时避免系统压力过高，像异丙醇这样粘度大的流动相,可适当降低流速。

在实际的实验中，我们有时也没必要一定要追求一个完美的理论塔板数，理论塔板数是反应分离效果的参数，只要被检测的物质之间或被检测的物质与相邻的物质完全分离或基本分离就可以，这样一般来说就不会影响分析结果。有时一味追求理论塔板数会带来分析时间长，工作效率低，增加实验成本，仪器或相关设备损耗大等等的负面影响或负担。

色谱分析时有一个理想的理论塔板数很重要，我们尽量达到，但在不影响分析结果（或实验要求）的前提下，我们也没必要非追求这个。