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【许愿原创】方法对了效果自然就好了

zdac

2014/07/31

方法对了效果自然就好了
阿胶为马科动物驴的皮去毛后熬制、浓缩而成，与人参、鹿茸一起被誉为“中药三宝”“滋补三宝”，有着奇特的中药功效，长期以来一直深受广大民众的青睐，尤其是广大女性朋友。它基本上被认为具有治病、防病圣药，滋补、养颜佳品，强身健骨、缓延衰老良方，调神、补血效果显著。送人礼品中不可或缺的佳品。

氨基酸向来是被认为是比较难测样品，尤其是阿胶中的氨基酸样品。重现性很难得到保证，检测结果可信度低，长期以来困扰着很多企业和实验室操作人员。很多人实验一做不出来就怀疑是仪器或样品的问题，其实不然，实验方法也很重要，实验方法也是决定实验成败的重要因素。

药典中的方法不一定是完美的方法，下面我们就介绍下比药典中方法更完美的检测阿胶中氨基酸的方法。

这个方法中很关键也是很容易被忽略的一点就是梯度洗脱。下面我们就重点介绍下梯度洗脱检测阿胶中四种氨基酸含量的方法。

仪器及试剂

仪器：高效液相色谱仪（二元高压梯度配置，柱温箱），柱前衍生仪

试剂：0.1mol/L盐酸，乙腈（色谱纯），超纯水，醋酸钠溶液，0.1mol/L异硫氰酸苯酯（PITC），1.0mol/L三乙胺，正已烷

标准品：羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸标准品（来自国家标准化物质中心）

色谱条件

色谱柱：VenusilXBP C18 （4.6 X 250mm,5ul）

V9520525CK0043

柱温：43℃

检测波长：254nm

流速：1.0mL/min

进样量：10uL（对照品溶液与供试品溶液都得进行柱前衍生化处理）

流动相条件：A：乙腈-0.1mol/L醋酸钠溶液（用醋酸调节pH值6.5）（7：93）

B：乙腈-水（4：1）

药典梯度表及图谱：

时间（min）

A%

B%

流速（mL/min）

0

100

0

1.0

11

93

7

1.0

13.9

88

12

1.0

14

85

15

1.0

29

66

34

1.0

30

0

100

1.0

第一针图谱：

第一针谱图效果不错，完全符合要求，但我们不要被个别现象迷惑双眼，接着往下看。

第二针图谱：

这个就不那么完美，我们做实验的都能看出来，这样的结果我们一般是很难接受的了。再接着往下看，下面情况可能会怎样？

第三针图谱：

这个效果我们可能是无法接受的了。下面就更差了，就不多介绍了。究竟为什么，第一针很完美，下面一针不如一针？

下面我们就改变下这个梯度方法，看看效果如何。

其它色谱条件不变，微微的改变下梯度方法：

时间（min）

A%

B%

流速（mL/min）

0

100

0

1.0

1

99

1

1.0

11

93

7

1.0

13.9

88

12

1.0

14

85

15

1.0

29

66

34

1.0

30

0

100

1.0

40

0

100

1.0

41

100

0

1.0

55

100

0

1.0

对照品图谱：

效果不错吧，比较我们吧，这样的谱图和实验数据交差完全没问题吧。其实也没什么，这是微微的改变一下实验条件，完美效果就出来了。大家感觉到实验条件的魅力了吧。

这个样品的难点是色谱峰形难保证，分离度难保证，准确度、重现性难保证。色谱柱的洗脱能力是有限的，药典中没有注明色谱柱的再生过程及下一次实验前的平衡过程,这在实验过程中非常重要,否则就会影响色谱峰宽、峰拖尾、肩峰、分离度差、重复性差等重要指标。这样的色谱条件带来的不良效果大家从以上谱图也不难看出。

此方法成功的关键是梯度表中的后三步，30-40分钟是对色谱柱再生过程，40-55分钟是系统再平衡过程。这两步对于做复杂样品非常重要，希望大家重视！另外增加第二步是为了克服有些液相泵在小流速时流速不准确，而且难启动的现象。

另外选择色谱柱也很重要,色谱柱选择好的话,检测时间短,色谱图漂亮,分离度好,检测数据准确可靠。

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dahua1981

第1楼2014/08/01

应助达人

色谱柱和色谱条件是优化选择很关键

0

逆天一棍

第2楼2014/08/01

梯度本来就是一个一直变化的过程，给予一定的再平衡时间非常有必要，而且非常重要！

0

zdac

第3楼2014/08/01

是这样，老兄高见
dahua1981(dahua1981) 发表:色谱柱和色谱条件是优化选择很关键

0

zdac

第4楼2014/08/01

前一针的冲洗、平衡是下一针成败的基础
逆天一棍(fengmo4668) 发表:梯度本来就是一个一直变化的过程，给予一定的再平衡时间非常有必要，而且非常重要！

0

好日子

第5楼2014/08/02

对，这也是一个因素

0

bingwang228

第6楼2014/08/02

应助达人

梯度洗脱中平衡时间对下一样品的检测非常重要，同时，样品中组分若没有完全洗脱出来对下一针也就产生了干扰。氨基酸检测中，样品中一般都含有多种氨基酸，样品需要都做一段时间，将其他组分洗脱出来

0

不怕高

第7楼2014/08/03

有道理，方法对了效果自然就好了

0

吕梁山

第8楼2014/08/04

梯度洗脱的条件优化还是有一定挑战性的

0

吕梁山

第9楼2014/08/04

一个梯度洗脱一个小时，也太长了吧

0

逆天一棍

第10楼2014/08/09

是。平衡时间不够，往往会导致保留时间的漂移。
zdac(zdac) 发表:前一针的冲洗、平衡是下一针成败的基础

0

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