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霍乱弧菌实时PCR快速检测方法之应用

食品毒素/微生物检测

  • 霍乱弧菌实时PCR快速检测方法之应用

    摘要:实时PCR检测霍乱弧菌的快速方法,应用于霍乱监测。

    总结:弧菌属广泛分布于自然界,尤其水中为多,有100多种,主要致病为霍乱弧菌和副溶血弧菌。前者引起霍乱,后者引起食物中毒。霍乱为甲类传染病,以传播快,发病急,流行面广而备受重视。如何及时控制霍乱的发生,早发现、早诊断是关键。目前霍乱弧菌检测仍以传统培养法为主,其操作繁琐,耗时长。随着分子生物学技术的发展,人们采用PCR技术应用于细菌的快速诊断。然而传统PCR技术易污染,造成检测失败。自1995年美国PE公司提出实时PCR检测原理后,实时PCR以其快速、定量、无需后电泳、无交叉污染等突出优点而被广泛采用[1]。本文采用探针技术建立霍乱弧菌的实时PCR方法,并用于霍乱的快速诊断,现将结果报告如下。
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  • 会师楼

    第1楼2014/08/19

    1 材料和方法
    1.1 菌株 12种细菌共100株细菌。包括1株沙门氏菌、1株志贺氏菌、1株大肠杆菌、1株金黄色葡萄球菌、1株蜡样芽胞杆菌、1株李斯特氏菌、1株溶藻弧菌、1株河弧菌、1株创伤弧菌、1株变形杆菌、40株副溶血弧菌和50株霍乱弧菌。霍乱弧菌的分离鉴定和肠毒素实验按照《霍乱防治手册》操作。其他11种细菌的分离和鉴定均按照中华人民共和国颁布的《食品微生物学》国家检验标准操作。
    1.2 菌样模板提取 (1)DNA提取:菌株经LB增菌培养过夜后,菌体用500ul TE buffer 悬浮,加入终浓度为50ug/ul溶菌酶,37℃作用1小时,然后再加入终浓度为1% SDS 和0.2ug/ul的蛋白酶K,55℃作用1小时后,用酚-氯仿抽提DNA。(2)取1ml菌液,离心沉淀,制备菌悬液,煮液,取上清液5ul即可用于实时PCR反映。
    1.3 样品模板DNA提取 (1)大便、呕吐物标本:用生理盐水悬浮,煮沸,10000rpm离心2min,取5ul上清液即可用于实时PCR反映。(2)食品样品:用碱性蛋白胨水增菌6-8小时后,取1ml菌液富集,煮沸,再取5ul上清液即可用于实时PCR反映。上述方法不需酚-氯仿抽提,快速简便有效,适于大批样品的模板提取。
    1.4 霍乱弧菌检测体系的建立
    1.4.1 引物和探针设计 根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因(xtxA)的序列并比较分析,自行设计一对引物和探针,扩增片段为80bp。引物和探针均由AB(applied biosystems)公司合成。
    1.4.2 PCR反应条件 反应总体积为25ul,内含5ul模板,2.5ul 10×PCR缓冲液,1.5mmolMgCl2,0.25mmol/L dNTP,1UTaq酶,25pmol引物,25pmol探针。实时PCR反应参数为:94℃预变性5min,40个循环中94℃变性45S,62℃退火1min,72℃延伸1min。采用ABI7500实时PCR扩增仪退火阶段检测荧光。
    1.4.3 特异性检测 以沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、蜡样芽胞杆菌、李斯特氏菌、溶藻弧菌、河弧菌、创伤弧菌和副溶血弧菌的DNA作对照,对霍乱弧菌进行ctxA实时PCR扩增。
    1.4.4 灵敏度分析 选一株小川型霍乱弧菌(编号为 V32)作为灵敏度分析的代表株。包括DNA灵敏度分析和菌液灵敏度分析。DNA灵敏度分析按常规DNA方法提取模板DNA。用eppendorf biophotometer核酸蛋白测定仪测DNA浓度,然后进行5倍稀释,每个稀释度取1ul用于实时PCR反应,菌液灵敏度分析为V32菌株经碱性蛋白胨水(APW)增菌过夜后,进行10倍稀释,工作10个稀释度,然后依次取10个稀释度的1ml菌液进行实时PCR反应。同时相对应的按中华人民共和国颁布的《食品微生物检验标准》做细菌总数计数。[2]

    1 结果

    2.1特异性分析 12种细菌经实时PCR检测,只有霍乱弧菌肠毒素试验阳性的霍乱弧菌有荧光信号,其他细菌无荧光信号。见表1



    2.2灵敏度结果霍乱弧菌DNA灵敏度为102.4fg/ul,菌液灵敏度为3cfu/PCR反应体系,对原始样品而言,菌液灵敏度为32cfu/ml。见过见表2-3。

    表2霍乱弧菌实时PCR检测体系DNA灵敏度



    表3霍乱弧菌实时PCR检测体系菌液灵敏度



    3讨论

    本文建立了实时PCR检测霍乱弧菌的方法。研究表明:(1)此方法灵敏度高,每毫克或每毫升样品含32个细菌,即可检出。(2)特异性强,与对照组11种细菌无交叉反应。(3)操作简单,结果观察直观明了,可一次检测96份标本(含阴、阳性对照)。(4)适用于霍乱弧菌的快速诊断和大量样品的检测。检测大便标本仅需2h检测时间,检测海产品标本仅需1天时间。在单一实时PCR研究的基础上,最终实现多重时PCR同时诊断10种食源性致病菌,满足常见食源性疾病的快速诊断的要求。

    霍乱作为甲类传染病,一直受到各级政府的重视,腹泻病人和外环境的霍乱监测是霍乱防治的重点。外环境监测包括水和海产品检测。由于水和海产品中含大量弧菌,采用传统方法往往需花很多时间用于霍乱弧菌和其他弧菌的区别,耗时耗力,因此需采用简便快速的检测技术达到快速筛选的目的,荧光PCR技术以其灵敏、操作简单、不需后电泳的特点满足了快速检测的需要。而且编码霍乱肠毒素A亚单位的基因(ctxA)是O1群霍乱弧菌和O139群霍乱弧菌的一个最重要的毒力因子。

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  • 会师楼

    第2楼2014/08/19

    结论:实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于霍乱的快速诊断,为霍乱的分子流行病学调查提供新的检测手段。
    参考文献:
    [1].Blackstone GM,Nordstrom JL. Detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus in oyster enrichements by real-time PCR[J].Journal of Microbiological Methods,2003,53:149-155
    [2]Chen shu,Yee Arlene. The evaluation of a fluorogenic polymerase chain reaction assay for the detection of Salmonella species in food commodities[J].International Journal of food Microbiology,1997,35:239-250.

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  • 会师楼

    第3楼2014/08/19

    第二帖子的 表格 是不是 有问题了。
    看来要 传 图片了。

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  • 想有个个性签名

    第4楼2014/08/20

    我看着 好像 也有问题了。

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  • 我是风儿

    第5楼2014/08/20

    应助达人

    是要发图片形式的

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  • 该帖子已被版主-会师楼加5积分,加2经验;加分理由:欢迎讨论
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  • huangza

    第7楼2014/08/20

    应助达人

    楼主‘原创很高产啊,支持原创!

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  • 会师楼

    第8楼2014/08/26

    整好了。呵呵。

    我是风儿(nphfm2009) 发表:是要发图片形式的

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  • 喜欢你好

    第9楼2014/08/28

    PCR的检测试验现在已经很多了吧。

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  • 会师楼

    第10楼2014/08/28

    是啊,基本上普及了。

    喜欢你好(v2929857) 发表:PCR的检测试验现在已经很多了吧。

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