仪器信息网APP

选仪器、听讲座、看资讯

立即体验

当前位置：仪器社区 >食品检测 > 兽药/抗生素检测 > 帖子详情

土霉素、金霉素和四环素的日本检测方法

被风吹过的夏天

2014/09/13

私聊

兽药/抗生素检测

土霉素、金霉素和四环素的检测方法

1. 分析目标化合物
土霉素，金霉素，四环素
2. 仪器设备
带荧光检测器的高效液相色谱仪。
3．试剂
除下列试剂外，使用附录2所列试剂。
咪唑：特级
咪唑缓冲溶液：将68.08g咪唑、0.37g EDTA 和10.72g乙酸镁溶解在800mL水中，用乙酸调节pH7.2后，加水至1,000mL。
含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液：第1液：将21.0g柠檬酸溶解在水中至1,000mL。第2液：将71.6g磷酸氢二钠溶解在水中至1,000mL。在1.86g乙二胺四乙酸中加入307mL第1液和193mL第2液混合的溶液溶解。
苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱 (265mg)：在内径8～9mm 聚乙烯管中填充265mg柱色谱用苯乙烯二乙烯苯共聚物或具有同等分离特性的物质。
4．标准品
盐酸土霉素：本品1.000mg 含有土霉素0.850mg以上效价，分解点为190℃～194℃。
盐酸金霉素：本品1.000mg含有盐酸金霉素0.900mg以上效价，分解点为210℃以上。
盐酸四环素：本品1.000mg 含有盐酸四环素0.900mg以上效力，分解点为214℃以上。
5．试验溶液的制备
a 提取方法
①肌肉、肝脏和肾脏
肌肉：尽可能除去脂肪层，搅碎混合均匀后，称取其5.00g。
肝脏和肾脏：搅碎混合均匀后，称取其5.00g。
加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，搅拌1分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，水层移入100mL分液漏斗中。离心分离管的残留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，用振荡器激烈振荡1分钟后，按上述同样条件离心分离，合并水层于上述分液漏斗中。加入20mL正己烷, 用振荡器激烈振荡5分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，分取水层。
- 脂肪
  脂肪：尽可能除去肌肉层，搅碎混合均匀后，称取其20.0g。
  加入200mL正己烷，搅拌1分钟后，加入40mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，再搅拌1分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，分取水层。正己烷层中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，用振荡器激烈振荡1分钟后，按上述同样条件离心分离，分取水层，合并于先分取的水层中。
- 奶
  称取5.00g样品，加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液和20mL正己烷，用振荡器激烈振荡5分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，分取水层。
- 蛋

相关话题

+关注

私聊

被风吹过的夏天

第1楼2014/09/13

应助达人

除去蛋壳，充分均匀后，称取其5.00g。加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，均匀后，加入100mL正己烷，搅拌1分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，水层移入100mL分液漏斗中。离心管的残留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，用振荡器激烈振荡1分钟后，按上述同样条件离心分离，合并水层于分液漏斗中。加入20mL正己烷, 用振荡器振荡5分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，分取水层。
⑤ 鱼贝类
有壳贝类：除去壳，搅碎混合均匀后，称取其5.00g。
其它的鱼贝类：搅碎混合均匀后，称取其5.00g。
加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，搅拌1分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，水层移入100mL分液漏斗中。离心管的残留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，用振荡器激烈振荡1分钟后，按上述同样条件离心分离，合并水层于分液漏斗中。加入20mL正己烷, 用振荡器激烈振荡5分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，分取水层。
b 净化方法
在苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱（265mg）中，顺次注入10mL甲醇、10mL水和5mL饱和EDTA溶液，弃去流出液。柱中注入a提取方法所得的溶液后，注入10mL水，弃去流出液。注入10mL甲醇，收集流出液于磨口减压浓缩器中，40℃以下除去甲醇。残留物中加入1.0mL 1.36％磷酸二氢钾溶液溶解，此为试验溶液。
6．操作方法
a 定性试验
按下列操作条件进行试验，试验结果必须与标准品的一致。
操作条件
柱填充剂：十八烷基甲硅烷基化硅胶(粒度5μm)。
柱：内径4.0～6.0mm，长150mm不锈钢管。
柱温：40℃
检测器：激发波长380nm，发射波长520nm。
流动相：土霉素和四环素试验时，用咪唑缓冲溶液：甲醇(17：3)的混合溶液。调整流速使土霉素约5分钟流出。
金霉素试验时，用咪唑缓冲溶液：甲醇(3：1)的混合溶液。调整流速使金霉素约7分钟流出。
b 定量试验
根据与a定性试验相同操作条件所得的试验结果，峰高法或峰面积法定量。
7．定量限
a 肌肉，肝脏，肾脏，奶，蛋和鱼贝类
土霉素：0.02 mg/kg
金霉素：0.03 mg/kg
四环素：0.02 mg/kg
b 脂肪
土霉素：0.005 mg/kg
8．注意事项
(1) 试验溶液的制备
① 离心分离温度保持在室温。
② 抽滤后滤液混浊时，滤液再次进行离心分离。

+关注

私聊

被风吹过的夏天

第2楼2014/09/13

应助达人

③ 在苯乙烯二乙烯苯共聚物柱色谱中，注入试验溶液后，30mL水分数次加入效果较好地洗浄柱中残留的乙二胺四乙酸。
(2) 标准溶液的配制
①称取相当于10.0mg土霉素的标准品，溶解在甲醇中至10mL，作为土霉素的标准原液（土霉素1,000mg（效价）／L，1,000mg／L）。本标准原液保存在-20℃，1年内稳定。
②称取相当于10.0mg金霉素的标准品，溶解在甲醇中至10mL，作为金霉素的标准原液（金霉素1,076mg（效价）／L，1,000mg／L）。本标准原液保存在-20℃，1年内稳定。
③称取相当于10.0mg四环素的标准品，溶解在甲醇中至10mL，作为四环素的标准原液（四环素1,082mg（效力）／L，1,000mg／L）。本标准原液保存在-20℃，1年内稳定。
④用1.36%磷酸二氢钾溶液将土霉素，金霉素和四环素各标准原液递减稀释，作为制作标准曲线用的标准溶液。
(3) 其它
①同时进行很多样品试验的筛选试验法提高判断効率时，用「○土霉素，金霉素和四环素的筛选法（参照117 页）」判断为陽性的，不妨用本检测方法实施试验。
②使用本检测方法检出土霉素，金霉素和四环素时，最好用带质量检测器的高效液相色谱仪确证。
9．参考文献
无
10．类型
A

+关注

私聊

被风吹过的夏天

第3楼2014/09/13

应助达人

原文

オキシテトラサイクリン、クロルテトラサイクリン及びテトラサイクリン試験法

１．	分析対象化合物オキシテトラサイクリン，クロルテトラサイクリン，テトラサイクリン

２．	装置蛍光検出器付き高速液体クロマトグラフを用いる。

３．

試薬,試液
次に示すもの以外は，総則の３に示すものを用いる。
イミダゾール　イミダゾール(特級)
イミダゾール緩衝液　イミダゾール68.08g，エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム0.37g及び酢酸マグネシウム10.72gを水に溶かして800mlとする。これに酢酸を加えてpH7.2に調整し，水を加えて1,000mlとする。
エチレンジアミン四酢酸含有クエン酸緩衝液　第1液：クエン酸21.0gを水に溶かして1,000mlとする。第2液：リン酸二ナトリウム71.6gを水に溶かして1,000mlとする。エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム1.86gに第1液307mlと第2液193mlを混和したものを加えて溶かす。
スチレンジビニルベンゼン共重合体ミニカラム(265mg)　内径8～9mmのポリエチレン製のカラム管に，カラムクロマトグラフィー用に製造したスチレンジビニルベンゼン共重合体265mgを充てんしたもの又はこれと同等の分離特性を有するものを用いる。

４．	標準品塩酸オキシテトラサイクリン　本品1.000mgは，オキシテトラサイクリン0.850mg力価以上を含む。　分解点　本品の分解点は190～194°である。塩酸クロルテトラサイクリン　本品1.000mgは，塩酸クロルテトラサイクリン0.900mg力価以上を含む。　分解点　本品の分解点は210°以上である。塩酸テトラサイクリン　本品1.000mgは，塩酸テトラサイクリン0.900mg力価以上を含む。　分解点　本品の分解点は214°以上である。

５．

試験溶液の調製
a　抽出法
(1)筋肉，肝臓及び腎臓の場合
　筋肉の場合は，可能な限り脂肪層を除き，細切均一化した後，その5.00gを量り採る。
　肝臓及び腎臓の場合は，細切均一化した後，その5.00gを量り採る。
　これにエチレンジアミン四酢酸含有クエン酸緩衝液30mlを加え，1分間細砕した後，毎分3,000回転で10分間遠心分離を行い，水層を100mlの分液漏斗中に移す。遠心分離管の残留物にエチレンジアミン四酢酸含有クエン酸緩衝液20mlを加え，振とう機を用いて1分間激しく振り混ぜた後，上記と同様の条件で遠心分離を行い，水層をその分液漏斗中の水層に合わせる。これにn－ヘキサン20mlを加え，振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，毎分3,000回転で10分間遠心分離を行い，水層を分取する。

(2)脂肪の場合
　可能な限り筋肉層を除き，細切均一化した後，その20.0gを量り採る。
　これにn－ヘキサン200mlを加え，1分間細砕した後，エチレンジアミン四酢酸含有クエン酸緩衝液40mlを加え，さらに1分間細砕した後，毎分3,000回転で10分間遠心分離を行い，水層を分取する。n－ヘキサン層にエチレンジアミン四酢酸含有クエン酸緩衝液20mlを加え，振とう機を用いて1分間激しく振り混ぜた後，上記と同様の条件で遠心分離を行い，水層を分取して，先の水層に合わせる。

(3)乳の場合
　試料5.00gを量り採り,エチレンジアミン四酢酸含有クエン酸緩衝液30ml及びn－ヘキサン20mlを加え,振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜる。次いで毎分3,000回転で10分間遠心分離を行い,水層を分取する。

(4)卵の場合
　卵の殻を除き，十分均一化した後，その5.00gを量り採る。これにエチレンジアミン四酢酸含有クエン酸緩衝液30mlを加え，均一化した後，n－ヘキサン100mlを加え，1分間細砕した後，毎分3,000回転で10分間遠心分離を行い，水層を100mlの分液漏斗中に移す。遠心分離管の残留物にエチレンジアミン四酢酸含有クエン酸緩衝液20mlを加え，振とう機を用いて1分間激しく振り混ぜた後，上記と同様の条件で遠心分離を行い，水層をその分液漏斗中の水層に合わせる。これにn－ヘキサン20mlを加え，振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，毎分3,000回転で10分間遠心分離を行い，水層を分取する。

(5)魚介類の場合
　殻付きの貝類の場合は，殻を除き，細切均一化した後，その5.00gを量り採る。
　その他の魚介類の場合は，細切均一化した後，その5.00gを量り採る。
　これにエチレンジアミン四酢酸含有クエン酸緩衝液30mlを加え，1分間細砕した後，毎分3,000回転で10分間遠心分離を行い，水層を100mlの分液漏斗中に移す。遠心分離管の残留物にエチレンジアミン四酢酸含有クエン酸緩衝液20mlを加え，振とう機を用いて1分間激しく振り混ぜた後，上記と同様の条件で遠心分離を行い，水層をその分液漏斗中の水層に合わせる。これにn－ヘキサン20mlを加え，振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，毎分3,000回転で10分間遠心分離を行い，水層を分取する。

b　精製法
　スチレンジビニルベンゼン共重合体ミニカラム(265mg)に，メタノール10ml，水10ml，飽和エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム溶液5mlを順次注入し，流出液は捨てる。このカラムにa　抽出法で得られた溶液を注入した後，水10mlを注入し，流出液は捨てる。このカラムにメタノール10mlを注入し，流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り，40°以下でメタノールを除去する。この残留物に1.36％リン酸一カリウム溶液1.0mlを加えて溶かし，これを試験溶液とする。

+关注

私聊

被风吹过的夏天

第4楼2014/09/13

应助达人

６．

操作法
a　定性試験
　次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。
操作条件
　カラム充てん剤　オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)を用いる。
　カラム管　内径4.0～6.0mm，長さ150mmのステンレス管を用いる。
　カラム温度　40°
　検出器　励起波長380nm，蛍光波長520nmで操作する。
　移動相　オキシテトラサイクリン及びテトラサイクリンの試験を行う場合は，イミダゾール緩衝液及びメタノールの混液(17：3)を用いる。オキシテトラサイクリンが約5分で流出する流速に調整する。クロルテトラサイクリンの試験を行う場合は，イミダゾール緩衝液及びメタノールの混液(3：1)を用いる。クロルテトラサイクリンが約7分で流出する流速に調整する。
b　定量試験
　a　定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

７．	定量限界 a　筋肉，肝臓，腎臓，乳，卵及び魚介類の場合　オキシテトラサイクリン　0.02 mg/kg 　クロルテトラサイクリン　0.03 mg/kg 　テトラサイクリン　0.02 mg/kg b　脂肪の場合　オキシテトラサイクリン　0.005 mg/kg

+关注

私聊

被风吹过的夏天

第5楼2014/09/13

应助达人

８．

留意事項

(１)

　試験溶液の調製

(1)	遠心分離中の温度は室温に保持すること。
(2)	吸引ろ過後ろ液が濁っている場合は，再度ろ液について遠心分離を行うこと。
(3)	スチレンジビニルベンゼン共重合体カラムクロマトグラフにおいて，試験溶液を注入後，水30mlを数回に分けて，効率よくカラム中に残留するエチレンジアミン四酢酸を洗浄すること。

+关注

私聊

被风吹过的夏天

第6楼2014/09/13

应助达人

(２)

　標準溶液の調製

(1)	オキシテトラサイクリン10.0mgに相当する標準品をメタノールに溶解して10mlとし，オキシテトラサイクリン標準原液とすること（オキシテトラサイクリン1,000mg（力価）／l，1,000mg／l）。本標準原液は，－20°保存で１年間安定であること。
(2)	クロルテトラサイクリン10.0mgに相当する標準品をメタノールに溶解して10mlとし，クロルテトラサイクリン標準原液とすること（クロルテトラサイクリン1,076mg（力価）／l，1,000mg／l）。本標準原液は，－20°保存で１年間安定であること。
(3)	テトラサイクリン10.0mgに相当する標準品をメタノールに溶解して10mlとし，テトラサイクリン標準原液とすること（テトラサイクリン1,082mg（力価）／l，1,000mg／l）。本標準原液は，－20°保存で１年間安定であること。
(4)	オキシテトラサイクリン，クロルテトラサイクリン及びテトラサイクリン各標準原液を1.36％リン酸一カリウム溶液で逓減希釈し，検量線作成用標準溶液とすること。

(３)

　その他

(1)

　同時に多数の検体の試験を行う等スクリーニング試験法を併用した方が効率的と判断される場合には，「○オキシテトラサイクリン，クロルテトラサイクリン及びテトラサイクリンのスクリーニング法（117ページ参照）」を用いて陽性と判断されたものについてのみ，本試験法による試験を実施しても差し支えないこと。

(2)

　本試験法によりオキシテトラサイクリン，クロルテトラサイクリン及びテトラサイクリンが検出された場合には，質量検出器付き高速液体クロマトグラフを用いて確認することが望ましいこと。

９．

参考文献
なし

+关注

私聊

被风吹过的夏天

第7楼2014/09/13

应助达人

○

オキシテトラサイクリン，クロルテトラサイクリン及びテトラサイクリンのスクリーニング法

１

　試験菌液の調製

　継代保存した試験菌株（Ｂacillus mycoides　ＡＴＣＣ　11778を用いる。以下試験菌株という。）を継代保存用培地に塗抹し，30°で１週間培養して芽胞を形成させる。なお，この場合，芽胞染色して顕微鏡で確認し，１視野に80％以上の芽胞が形成していることを確認すること。芽胞形成が悪い場合は，さらに10日間以上培養し，改善が認められない場合には，試験菌の変異等が考えられるので，このような試験菌は使用しないこと。
　次いで継体保存用培地上に発育した菌苔をかきとって滅菌生理食塩水に浮遊させた後，65°で30分間加熱する。これを毎分3,000回転で20分間遠心分離し，沈殿を滅菌生理食塩水に再び浮遊させ，これを芽胞原液とする。この芽胞原液を用いて逓減希釈液を作り，これらの希釈液を約50°に保温した種層用培地に１％の割合で混和し，それぞれの８mlをペトリ皿（内径80～90mmの滅菌したペトリ皿を用いる。以下ペトリ皿という。）に流して平板とする。各平板上にオキシテトラサイクリン0.2μg力価／mlを含ませたペーパーディスク（直径10mm，厚さ1.1～1.2mmのペーパーディスクを121°で15分間高圧滅菌し，十分乾燥させたものを用いる。以下ペーパーディスクという。）を置いたもの又は各平板上に置いた円筒（外径８mm，内径６mm，高さ10mmの乾熱滅菌した円筒を用いる。以下円筒という。）にオキシテトラサイクリン.2μg力価／mlを250μｌ注入したものを30°で17±１時間培養し，阻止円の直径が14±１mmを示す平板を見いだし，それに相当する希釈液を試験菌液とする。このときの芽胞数は10⁴～10⁵／mlとなっている。
継代保存用培地　培地1,000ml中，ペプトン10.0ｇ，肉エキス5.0ｇ，塩化ナトリウム2.5ｇ及び寒天15.0ｇを含むもの。滅菌後のpHを6.5±0.1に調整する。
種層用培地　培地1,000ml中，ペプトン6.0ｇ，肉エキス1.5ｇ，酵母エキス3.0ｇ及び寒天15.0ｇを含むもの。滅菌後のpHを5.8±0.1に調整する。

２

　試験溶液の調製

　試験溶液の調製は，オキシテトラサイクリン，クロルテトラサイクリン及びテトラサイクリン試験法にしたがって実施する。

３

　操作法

　滅菌後，菌の生育を阻害しない温度まで冷却した種層用培地に，試験菌液を１mlあたり10⁴～10⁵個になるよう添加し，十分に混和した後，その８mlをペトリ皿に流して水平に静置して固化させ検査用平板とし，以下に示す(１)又は(２)の方法を用いて操作する。
(１)　ペーパーディスクを用いる方法
　検査用平板上に，試験溶液及び0.2μg力価／mlのオキシテトラサイクリン標準品溶液を浸したペーパーディスクを，約10分間風乾した後，各ペーパーディスクを正方形の各頂点の対角になるよう配置し，ピンセットの先で軽く固着させる。これを30分間以上冷蔵放置後，30±１°で17±１時間培養する。

+关注

私聊

被风吹过的夏天

第8楼2014/09/13

应助达人

培養後，形成された阻止円の直径を測定し，それぞれ２箇所の平均値を求める。
　試験溶液から得られた阻止円直径（平均値）が，0.2μg力価／mlのオキシテトラサイクリン標準品溶液から得られた阻止円直径（平均値）以上のものを陽性と判断する。なお，この場合の阻止円直径は14mm程度である。
(２)　円筒平板を用いる方法
　検査用平板上に４個の円筒をそれぞれ正方形の各頂点となるよう配置し，対角になる２個の円筒に試験溶液及び0.2μg力価／mlのオキシテトラサイクリン標準品溶液をそれぞれ250μlを注入し，30±１°で17±１時間培養する。培養後，形成された阻止円の直径を測定し，それぞれ２箇所の平均値を求める。
　試験溶液から得られた阻止円直径（平均値）が，0.2μg力価／mlのオキシテトラサイクリン標準品溶液から得られた阻止円直径（平均値）以上のものを陽性と判断する。なお，この場合の阻止円直径は18mm程度である。

４

　その他

　本法による定量限界は，0.2μg力価／mlの標準品溶液と同等の阻止円を形成した場合，脂肪以外において0.04ppm，脂肪において0.01ppmである

+关注

私聊

被风吹过的夏天

第9楼2014/09/20

应助达人

日本对于中国的虾一直命令检查金霉素，希望对大家有所帮助

+关注

私聊

lifengsasa

第10楼2016/08/01

大侠，国标GB/T 5009.116-2003畜、禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定中所用的标品是：土霉素CAS:79-57-2; 四环素CAS:60-54-8；金霉素CAS:57-62-5
还是盐酸土霉素CAS:2058-46-0；盐酸四环素CAS:64-75-5；盐酸金霉素：64-72-2？盼回复
被风吹过的夏天(xndxlzm) 发表:日本对于中国的虾一直命令检查金霉素，希望对大家有所帮助