几丁质固定化猪胰脂肪酶（PPL）的研究

兰博周

2014/10/12

私聊

生物制药

固定化酶的性质受酶自身性质和载体材料共同影响。这两者之间的相互作用决定了固定化酶的物理化学和动力学特性。因此，载体材料的选择在整个酶的固定化过程举足轻重。尽管大家都意识到载体的重要性，但是迄今为止，仍然没有一种载体材料是通用的。想成为酶的通用性载体材料，必须拥有一系列的优秀特性：对蛋白质具有高的亲和力，和酶分子有直接可进行反应的功能团，可以进行化学修饰，具有亲水性，化学稳定性，一定的机械强度，比较容易形成不同的几何结构以提供相应的渗透性，其表面对于生物转移合适等等。毋庸置疑的，在药学，医学，食品业以及农业应用中，载体材料还须是无毒的，并且具有生物相容性。考虑到对公共健康和环境的友好性，载体材料还应该可以生物降解，更经济。

综合考虑到现在已经被人们用来做固定化的载体材料，包括无机材料和有机材料，天然的和人工合成的，几丁质是众多材料中性质非常优良的载体材料。

几丁质是天然的聚多糖，几丁质是世界上数量最多的一类可再生有机资源。几丁质是甲壳类动物的壳以及昆虫的外骨骼的主要成分，在生物圈中，每年都有大量的几丁质被合成和降解。

几丁质(chitin)是N-乙酰氨基葡萄糖以β-1,4糖苷键所连接而成的直链多糖，在许多溶剂中都是不溶解的。几丁质的结构与植物纤维素的结构非常相似，只是2号位碳原子上的羟基被乙酰氨基和氨基所取代，因此又称作动物纤维素。值得一提的是，几丁质不是简单的化学物质，在最初以及制造的过程中可呈现出多样化的结构。

实验部分

实验试剂和仪器

实验试剂：

猪胰脂肪酶Lipase from porcine pancreas，Type Ⅱ（sigma）；

牛血清蛋白（BSA，成都飞克生物试剂有限公司，分析纯）；

考马斯亮蓝G-250(沃宏化学品有限公司)；

聚乙二醇1500（PEG1500，成都市科龙化工试剂厂，分析纯）；

几丁质（sigma);

25%戊二醛（成都市科龙化工试剂厂）；

三丁酸甘油酯；

考马斯亮蓝G-250（国产）；

分析天平（万分之一级，Sartorius BS 124 S）。

其他无机盐试剂均为分析纯。

实验仪器：

紫外分光光度计（Hitachi,U-1900);

恒温振荡器（上海智城科学仪器有限公司 ZHWY-2102-C）；

低温冷冻离心机（日立CF15RX）；

涡旋混合仪（国产）；

pH计（雷磁科学仪器有限公司）

双水相纯化PPL

将猪胰脂肪酶400毫克溶解于10毫升1M pH=7.0的磷酸钠缓冲溶液中，4℃搅拌溶解4h，在低温离心机中以8000rpm离心10min，使未溶解的杂质沉淀除去，并且低温可以防止酶失活。

在10ml的离心管中，以磷酸氢二钾溶液含量为13%，PEG1500溶液含量为17%，3gPPL粗酶液，用pH=7.0的缓冲溶液定量到10g，做成双水相，轻轻来回倒，使整个体系混合均匀。混匀后在低温离心机中30000rpm离心10min，分离纯化PPL。可看到整个体系分为上下两相，上层为PEG层，下层为盐水层。PPL被萃取到PEG层。

离心后，将双水相放在冰箱上层4℃静置过夜。这一过程有利于无机盐分子，酶分子以及杂蛋白在双水相中的分离，使得到的PEG层中的PPL更为纯净。

几丁质载体固定PPL方法研究

几丁质不溶于弱酸和纯水中，可溶于一下强酸，如浓盐酸，浓硫酸，浓磷酸等。为得到几丁质小球，就需要先把几丁质溶解。

几丁质小球的制备

称取不同重量的几丁质粉末，溶解于不同浓度的浓盐酸中，70℃水浴搅拌，至几丁质溶解，待溶液冷却后，用注射器将几丁质溶液逐滴加入4mol/L的NaOH-30%甲醇溶液中[17]，几丁质不溶于碱性溶液和甲醇中，所以很快就析出白色几丁质小球。随着几丁质浓度的改变，几丁质小球的透明度也会随之发生变化。几丁质浓度越小，小球的透明度就越高。

小球做成后，立即倒掉碱溶液，并用大量的纯水冲洗小球，直到洗液呈中性。将洗好的小球浸泡在纯水中，于冰箱上层保存。

几丁质小球的活化

称取1g几丁质小球（湿重），用4mL含2%质量浓度的戊二醛，0.02mol/L的pH=8.0的磷酸钾缓冲溶液，在25℃下，于恒温摇床中以200rpm的转速活化4h。

将活化好的几丁质小球用大量的纯水进行冲洗，直至没有戊二醛残留。洗好后，将小球浸泡在纯水中，置于冰箱上层保存。

PPL的固定化

称取1g活化的几丁质小球（湿重）于10mL的烧瓶中，加入2mL通过双水相纯化过的PEG层的PPL，于摇床中4℃,200rpm进行固定化。

将PPL固定化一定时间后，取出小球，用适量pH=7.0的磷酸钠缓冲溶液洗去其表面残留的蛋白质，测试洗液的蛋白含量，以及固定化PPL的酶活。

蛋白质含量的测试（Bradford法）：

(1)制备牛血清蛋白（BSA）标准液（100μg/mL）

精确称取0.0010g牛血清蛋白，用纯水溶解后定容至10mL。再取1mL1mg/mL的BSA溶液用纯水定容至10mL，即得到100μg/mL的BSA标准溶液。

(2)配制考马斯亮蓝溶液

显色液称取考马斯亮蓝G-250 100mg，溶于50ml95％乙醇后，加入85％磷酸100mL，再用蒸馏水稀释至1000mL。试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7％(W/V)乙醇，和8.5％(W/V)磷酸。该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。

(3)标准曲线的制作

准确量取0.1mL,0.2mL,0.4mL,0.6mL,0.8mL的100μg/mLBSA标准溶液于试管中，用纯水稀释成1mL。以1mL纯水为空白，加入5mL考马斯亮蓝溶液染色3-4分钟。用紫外分光光度计检测595nm处的紫外吸收。

以A=595nm处的吸光度为x,以标准值蛋白质含量为y,得到蛋白质含量的标准曲线,y=0.1698x-0.0087,R2=0.9952。

实验考察了不同几丁质浓度，不同盐酸浓度，不同氢氧化钠浓度对几丁质小球成球的影响，以及制作出的小球经过不同戊二醛浓度活化以后固定PPL的能力。

结果如下表所示：

几丁质含量
盐酸
NaOH-甲醇
成球情况
戊二醛含量
8%
12N
4M
是
2%
8%
6N
4M
否
---
5%
12N
4M
是
2%
5%
10N
4M
是
2%
5%
9N
4M
是
5%
5%
8N
4M
是
5%
5%
6N
4M
否
---
4%
10N
4M
是
2%
3%
12N
6M
否
---

通过实验和上表可知，几丁质制作小球最低浓度为4%，最低氢氧化钠浓度为4mol/L，最低盐酸浓度为8mol/L。几丁质溶液中几丁质百分比越高，小球的透明度就越低，几丁质百分比越小，小球的透明度就越好。透明度小，那么小球的孔径应该较大一些，结构更有利于酶分子的进入。

将几丁质小球通过不同浓度的戊二醛进行活化以后，用来固定PPL。结果发现，它们都能不同程度的固定一定的酶量，但是都不能使三丁酸甘油脂发生水解，测不出酶活。推测原因有两种，一是几丁质小球上固定的酶量太少，起到的催化效果非常微弱，测不出酶活；二是由于几丁质溶液是强酸性的，盐酸浓度非常高，在将几丁质溶液滴入氢氧化钠-甲醇溶液中成球时，起内部的盐酸并没有被完全中和掉，做固定化时，酶分子可能因接触到强酸环境而使其失活。

小结

通过几丁质小球利用戊二醛交联对纯化过的猪胰脂肪酶进行固定化，结果发现，几丁质作为载体材料来固定酶具有很多优越性，其资源丰富，对酶分子无毒性，并且容易进行化学改性。但是此次结果中未测出酶活，我们也分析了具体原因，准备换一种材料固定PPL，进一步的实验还在努力当中，希望能得到理想的实验结果

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分
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几丁质含量	盐酸	NaOH-甲醇	成球情况	戊二醛含量
8%	12N	4M	是	2%
8%	6N	4M	否	---
5%	12N	4M	是	2%
5%	10N	4M	是	2%
5%	9N	4M	是	5%
5%	8N	4M	是	5%
5%	6N	4M	否	---
4%	10N	4M	是	2%
3%	12N	6M	否	---