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联合用药血浆样品中抗真菌药物的快速同时测定

zhouleizi

2014/10/28

前处理综合讨论

联合用药血浆样品中抗真菌药物的快速同时测定

真菌感染是临床上表现严重的而且难攻可的难题，而且发病率高可导致死亡。抗真菌药伏立康唑，泊沙康唑，伊曲康唑以其广谱抗菌性是临床上被广泛地用于抗真菌感染的三唑类抗真菌药。伊曲康唑的主要代谢产物羟基伊曲康唑的抗菌活性与伊曲康唑相媲美，三唑类抗真菌药的药理和毒理与其药物浓度存在浓度-效应关系。它们在血液中的浓度以及吸收、代谢、消除以及合并用药均存在差异。所以对这些药物的临床药物监测对于增强临床效果降低毒副作用有很重要的意义。

三唑类抗真菌药的临床检测需要快速简便的分析手段来分析血浆中的血药浓度，同时测定人体血浆中伏立康唑，泊沙康唑，伊曲康唑的分析方法多采用液相色谱 - 质谱（LC-MS）或LC-串联质谱法（LC-MS / MS）的方法，LC-MS/MS是近年来用于生物样品中药物定量测定的有力手段，然而，LC-MS/MS系统由于其昂贵价格导致普及性并不高，本实验开发了一种简单、快速、可靠而且普适性的高效液相色谱同时测定伏立康唑，泊沙康唑，伊曲康唑以及代谢产物羟基伊曲康唑的方法，适合普遍的临床及实验室。

高效液相色谱法通常需要复杂的样品前处理，如液-液萃取、固液-萃取、以及血浆的处理，这些过程不仅需要试剂更耗时严重，本实验中对方法进行了简化，一步除蛋白，样品离心后可直接上样。

材料和方法：

伏立康唑，泊沙康唑、伊曲康唑、羟基伊曲康唑标准品及药品，萘普生标准品，甲醇、乙腈（色谱纯）、实验室自制试验用水。

色谱条件：安捷伦1200，安捷伦 SB-Phenyl色谱柱(150mm×4.6mm×5μm)，检测波长260nm,流动相A 0.01M的磷酸盐缓冲液（pH3.5）流动相B（95％乙腈的水溶液），梯度洗脱情况如下：

标准储备溶液配制：伏立康唑和泊沙康唑均配置成1.0mg/ml（以游离碱计）的甲醇溶液，伊曲康唑制备成0.4mg/ml的甲醇溶液，羟基伊曲康唑配制成0.1mg/ml的甲醇溶液，内标溶液为0.6mg/ml萘普生甲醇溶液，皆4度保存备用。

标准曲线：：伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑、羟基伊曲康唑标准曲线绘制通过向空白血清中加入标准溶液来获得，浓度范围0.05-100mg/L。

样品制备：取100ul 10ug/ml的内标普萘生溶液分别加入100ul的空白、标准溶液、以及样品血浆中。混匀，加入25ul的1.0M的高氯酸是样品酸化，加入400ul的甲醇使蛋白质沉淀析出，离心2000转/min（5min），取上清液30ul进样。

结果与讨论

1、本实验建立了一种高效液相色谱法同时快速检测人体血浆中伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑以及伊曲康唑的代谢产物羟基伊曲康唑。

2、方法中使用了1.0M的高氯酸和甲醇作为蛋白质沉淀的方法，简单、快速。经过离心后，上层离心液经0.45um滤膜过滤后直接进样分析。

3、为了达到最佳的分离效果，我们比较了各种色谱柱，流动相我们对0.01M的磷酸盐缓冲液和不同浓度的甲醇、乙腈进行比较，得到优化的色谱条件：Phenyl色谱柱(150mm×4.6mm,5μm)上使用0.01M的磷酸盐缓冲液（pH3.5）、乙腈流动相梯度洗脱，波长260nm下进行检测。在该条件下：伏立康唑、萘普生、泊沙康唑、羟基伊曲康唑、伊曲康唑的保留时间及色谱图如下：

4、标准曲线在0.05-10mg/L范围内线性良好（r²=0.99，浓度范围0.05-10mg/L）,日内和日间变化系数<10%。

5 为了找到最简便快速的沉淀方法，对于沉淀剂进行了选择优化（甲醇乙腈高氯酸等），用乙腈和高氯酸沉淀效果皆很好，但综合考虑回收率高氯酸最优。

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夏天的雪

第1楼2014/10/28

应助达人

梯度程序刚开始的时候流动相A在0.01min内由70%变为50%，转换的有点快，在谱图的前部分出现了很大的溶剂峰；最后一步18min未给出流动相比例；最后一个组分出峰比较晚，梯度部分可以不降低有机相的比例，让其出峰提前一些。

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该帖子已被版主-999youran加5积分，加2经验;加分理由:参与讨论

999youran

第2楼2014/10/30

0.01min内由70%变为50%，应该仪器不能响应这快速的吧。分析的很到位。
夏天的雪(bingwang228) 发表:梯度程序刚开始的时候流动相A在0.01min内由70%变为50%，转换的有点快，在谱图的前部分出现了很大的溶剂峰；最后一步18min未给出流动相比例；最后一个组分出峰比较晚，梯度部分可以不降低有机相的比例，让其出峰提前一些。

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xiaowang13

第3楼2014/10/31

学习了，不错啊

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zhouleizi

第4楼2014/10/31

条件还有待改善感谢您的意见
999youran(999youran) 发表:0.01min内由70%变为50%，应该仪器不能响应这快速的吧。分析的很到位。

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