化妆品中甲醇的检测方法（气相色谱法）

化妆品中甲醇检测方法编制说明
1 任务来源
受国家食品药品监督管理总局药品化妆品注册管理司委托，根据食药监许函，开展化妆品中甲醇检测方法的修订，重新建立了化妆品中甲醇的检测-气相色谱法。
2 方法概述
2.1 仪器
Agilent公司7890A气相色谱仪，配有氢火焰离子化检测器（FID）；PE公司Clams 680气相色谱仪，配有氢火焰离子化检测器（FID），顶空进样器；超声波清洗器；涡旋混合器；顶空瓶；分析天平。
2.2 试剂与材料
甲醇标准品（Dr.Ehrenstorfer GmbH，99.8%），无甲醇乙醇（色谱纯，Merck KGaA，批号 K45251327 405），氯化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），高纯氮（99.999%），高纯氢（99.999%），无油压缩空气，经装5Å分子筛的净化管净化。
2.3 方法
详见标准。
3 方法研究
3.1 色谱柱的选择
甲醇沸点低，保留时间短，为了更好地分离甲醇，考察了5种色谱柱：
HP-5 (30m×0.530mm×2.65μm), DB-1701P (30m×0.320mm×0.25μm), DB-624 (60m×0.320mm×1.80μm), DB-225(30m×0.530mm×1.00μm), DB-WAXETR (30 m×0.320 mm×1.00 µm)，综合考虑分离效果，保留时间，灵敏度等因素，最终采用DB-WAXETR(30 m×0.320 mm×1.00 µm)毛细柱进行分离，效果更好。
3.2 柱箱温度的确立
选定最佳的毛细柱后，确立柱箱温度。因为甲醇沸点低，柱箱温度控制采用了程序升温条件，起始温度50 ℃，然后10 ℃/min升至120 ℃保持1 min，用于分离甲醇和乙醇及沸点与甲醇相近的化合物， 40 ℃/min升至230 ℃保持8 min，用于洗脱样品中高沸点的化合物，排空毛细柱，以便下一针样品的检测。检测结果显示，程序升温条件的设置非常好地分离了甲醇与它沸点相近的化合物。
3.3 进样口检测器参数的确立
对FID进样口检测器参数进行优化，采用进样口温度230 ℃，检测器250 ℃；气-液平衡法分流比20:1，进样量1.2ml；直接法和蒸馏法分流比50:1，进样量1μl；高纯氢气流量40ml/min，高纯空气流量400ml/min，载气流量1.0 ml/min。
3.4 分流比的选择
考察了四种分流比对甲醇峰的影响。见图1、2、3和4。图示表明，分流比为5:1和10:1时，柱子过载，影响甲醇的检测；分流比为20:1和50:1时，甲醇峰形对称，灵敏度高，甲醇检测较好。直接法进样成分多，为减少柱子的残留，选择分流比50:1；气-液平衡法进样成分少，选择分流比20:1。

图1 分流比为5:1甲醇的色谱图


图2 分流比为10:1甲醇的色谱图


图3 分流比为20:1甲醇的色谱图


图4 分流比为50:1甲醇的色谱图

3.5 样品提取方法
3.5.1 气-液平衡法
3.5.1.1 样品提取液浓度
乙醇和水按一定比例混合，作为样品中甲醇的提取液。考察了不同比例的乙醇水溶液，见表1。从表1可知，95%的乙醇溶液提取回收率稍低；0%，50%，75%乙醇溶液提取回收率可行，但试验发现0%乙醇溶液为提取液绘制标准曲线时，有时两针RSD相差很大，不稳定，不能满足检测重现性的要求；50%乙醇溶液同一浓度的灵敏度没有75%乙醇溶液高，且75%乙醇溶液回收率稍好于50%乙醇溶液，方法选择75%乙醇溶液作为气-液平衡法样品提取液。



表1不同浓度的乙醇溶液提取回收率
化妆品品种    不同浓度的乙醇水溶液（v/v）提取回收率 %
    0%    50%    75%    95%
洗发露    92.1    95.6    93.8    77.4
精华素    87.3    91.4    92.4    76.7
沐浴露    92.3    88.8    90.5    76.3
护肤霜    95.8    95.6    90.7    80.9
洁面啫喱    90.6    89.7    96.5    86.2
按摩霜    90.7    81.7    93.1    91.2
香 水    98.6    95.1    99.7    87.5
3.5.1.2 汽化温度的选择
甲醇沸点为64.7℃，考察65℃，70℃，80℃，90℃四个不同温度下样品中甲醇的回收率，见表2。结果表明65℃和70℃回收率较好，而80℃和90℃有个别样品回收率低，可能因为温度高，蒸气压加大，导致顶空瓶气压泄露，回收率降低。65℃回收率可行，但温度稍低，甲醇峰灵敏度低，方法采用70℃汽化温度。
表2 不同汽化温度提取回收率
化妆品品种    不同汽化温度提取回收率 %
    65℃    70℃    80℃    90℃
洗发露    91.9    93.5    91.5    95.2
精华素    84.5    92.5    93.6    96.4
护肤霜    91.9    92.0    5.0    37.3
洁面啫喱    89.9    91.2    87.5    91.2
按摩霜    83.3    85.0    65.4    0.5
香 水    95.2    97.3    94.7    15.1
3.5.2 直接法
样品经过无甲醇乙醇直接提取后，用无甲醇乙醇定容。毛细柱尽量避免水的进入，降低柱效，也使甲醇峰拖尾，水含量影响甲醇的测定。特别指出的是，香水和花露水等水质样品也需要无甲醇乙醇的提取稀释后进样，不建议直接进样，影响甲醇检测。见图5和图6。

图5 香水没稀释直接进样

图6 香水稀释后直接进样
3.5.3 蒸馏法
蒸馏法中最终样品溶液乙醇含量约为75%。＜75%乙醇溶液时，水分含量大，甲醇峰拖尾，影响甲醇的检测；＞75%乙醇溶液时，气压较高，回收率低，所以蒸馏法称样后加水50 ml，无甲醇乙醇35 ml，水浴加热蒸馏，无甲醇乙醇定容至 50.0 ml。特别提出的是如果采用蒸馏法提取样品，则标准曲线也需要蒸馏，见图7。由图可知，最下面经过蒸馏的曲线与最上面没有经过蒸馏的曲线相差较大，而与中间发胶样品蒸馏曲线相差不大，所以，甲醇含量在0~2.0 g/L范围内，建议采用标准曲线蒸馏。

图7 蒸馏法三种曲线
3.6 标准曲线
试验考察了三种方法（气-液平衡法、直接法、蒸馏法）的溶液标准曲线和方法标准曲线，对于气-液平衡法和直接法溶液标准曲线和方法标准曲线基本一致，在两条曲线计算的甲醇含量基本一致（见图8和图9），而蒸馏法溶液标准曲线和方法标准曲线有差异，所以建议气-液平衡法和直接法采用溶液标准曲线，而蒸馏法采用方法标准曲线，计算样品的甲醇含量。


图8 气-液平衡法标准溶液曲线和方法标准曲线

图9 直接法标准溶液曲线和方法标准曲线
4方法建议
通过对化妆品中甲醇检测方法的编制，建议化妆品中甲醇的检测采用气相色谱时首选气-液平衡法，分析组分少，干扰少，简单易行，准确快速；其次直接法，样品处理方便快捷，只是后期分析组分多，干扰稍多，但不影响前期甲醇的测定，如果香水和花露水样品采用直接法，则需要稀释后进样；最后是蒸馏法，蒸馏法不易控制，影响因素多，如果采用，标准曲线建议蒸馏。

化妆品中甲醇检测方法的方法学
1 方法特异性
将甲醇标准溶液加入到具有代表性的基质中，按标准方法分别处理溶剂、基质和加标基质后，基质成分没有对甲醇的测定造成干扰。
2 线性及线性方程
2.1 溶液标准曲线的配制
2.1.1 气-液平衡法
取浓度为10 g/L的甲醇标准溶液，配制成浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 g/L的标准系列溶液，取上述标准系列溶液各1.0 ml分别置于顶空瓶中，加75％乙醇（3.5） 10.0 ml，密封，摇匀，备用。
2.1.2 直接法
取浓度为10 g/L的甲醇标准溶液，用无甲醇乙醇配制成浓度为0.02、0.05、0.1、0.2、0.4 g/L的标准系列溶液，摇匀，备用。
2.1.3 蒸馏法
取浓度为10 g/L的甲醇标准溶液，经蒸馏后，配制成浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 g/L的标准系列溶液，摇匀，备用。
在本方法所确定的色谱条件下，对上述甲醇标准工作溶液进行色谱测定，记录相应的峰面积，以甲醇标准工作溶液浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）绘制溶液标准曲线，进行相关性分析。
2.2 基质标准曲线的配制
2.2.1气-液平衡法
取浓度为10 g/L的甲醇标准溶液，配制成浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 g/L的标准工作溶液，取上述标准工作溶液各1.0 ml分别加入到含有样品基质的顶空瓶中，样品每份1.0 g（精确至0.01 g），加75％乙醇（3.5）9.0 ml，密封，配制成0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 g/L的基质标准工作溶液。
2.2.2 直接法
取浓度为10 g/L的甲醇标准溶液，配制成浓度为0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 g/L的标准工作溶液，取上述标准工作溶液各1.0 ml 分别加入到含有样品基质的10ml刻度管中，样品每份2.0 g（精确至0.01 g），加无甲醇乙醇（3.4）定容，配制成0.02、0.05、0.1、0.2、0.4 g/L的基质标准工作溶液。
2.2.3 蒸馏法
称取样品10.0 g（精确至0.01 g），取浓度为10 g/L的甲醇标准溶液0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ml分别于250 ml蒸馏烧瓶中，加水50 ml，加无甲醇乙醇（3.4） 35 ml，氯化钠（3.7） 2.0 g，水浴加热蒸馏，收集蒸馏液于50.0 ml容量瓶中，至接近刻线，加无甲醇乙醇（3.4）定容，配制成 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 g/L的基质标准工作溶液，
在本方法所确定的色谱条件下，对上述基质标准溶液进行色谱测定，记录相应的峰面积，以甲醇标准工作溶液浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）绘制基质标准溶液曲线，进行相关性分析。
2.3 标准曲线和线性方程
表1 标准曲线、线性范围、线性方程及相关系数
处理方法    曲线类型    线性范围    线性方程    相关系数
气-液平衡法    溶液标准曲线    0.1-4.0 g/L    y=1126.7x+78.663    0.9997
    方法标准曲线    洗发露        y=1241.4x+25.857    0.9997
        凝胶        y=1210.8x+36.032    1.0000
        膏霜        y=1217x+45.905    0.9996
        化妆水        y=1196.6x+18.109    1.0000
        发胶        y=1225.3x+149.33    1.0000
        香水        y=1201.6x+44.811    0.9998
直接法    溶液标准曲线    0.02-0.4 g/L    y=113.0x+0.1945    0.9998
    方法标准曲线    洗发露        y=123.1x-0.5199    0.9995
        凝胶        y=126.8x-0.3836    0.9992
        膏霜        y=131.9x+0.2630    0.9997
        化妆水        y=125.3x-0.8432    0.99994
        发胶        y=111.5x+2.0155    0.9998
        香水        y=118.4x+1.0667    0.99993
蒸馏法    溶液标准曲线    0.1-2 g/L    y=85.398x-0.0549    1.0000
    方法标准曲线    标准溶液        y=68.274x+1.3032    0.9996
        发胶        y=72.317x-1.1932    0.9999
3 仪器的检出浓度和定量浓度
稀释并检测甲醇标准溶液，测定信噪比为10:1时，甲醇的浓度为仪器定量浓度；测定信噪比为3:1时，甲醇的浓度为仪器检出浓度，见表2 。
表2 仪器的检出浓度和定量浓度
处理方法    检出浓度（g/L）    定量浓度（g/L）
气-液平衡法    0.02    0.08
直接法    0.005    0.02
蒸馏法       
4 方法的检出浓度和定量浓度
向不含甲醇的空白基质中定量添加甲醇标准溶液，按标准处理方法处理后，测定信噪比为10:1时，添加的甲醇量为方法定量浓度；测定信噪比为3:1时，添加的甲醇量为方法检出浓度，见表3。
5 精密度
5.1 日内精密度
在本方法条件下，高低两个浓度的标准溶液室温放置，按不同方法处理后，一日内分别连续测定6次，计算RSD值，
5.2 日间精密度
在本方法条件下，高低两个浓度的标准溶液室温放置，按不同方法处理后，连续3天，每天分别连续测定6次，计算RSD值，
日内精密度和日间精密度的RSD均小于5%，本法日内精密度及日间精密度均符合《化妆品及其原料中禁限用物质检测方法验证技术规范》的要求（规定RSD不应超过5%）。

6 回收率
在化妆品基质中加入高低两个浓度的标准溶液，按不同方法处理后，代入到标准曲线方程中，计算样品中甲醇的浓度与实际加入量的比值，为提取回收率。
表6气-液平衡法提取回收率为92.0%～106.0%；表7直接法提取回收率为93.0%～107.0%；表8蒸馏法提取回收率为101.0%～109.0%，均符合《化妆品及其原料中禁限用物质检测方法验证技术规范》的要求（规定为85%～115%）。
7 稳定性
7.1 日内稳定性试验
在本方法条件下，高低两种不同浓度标准溶液，依照本法制备样品试液后，室温放置，分别于0h、2h、6h、12h、18h、24h测定，计算RSD，见表9。结果表明甲醇24小时稳定。
7.2 日间稳定性试验
在本方法条件下，高低两种不同浓度标准溶液，依照本法制备供试液后，室温放置，分别于0h、12h、24h、36h、48h、60h时测定，计算RSD，见表10。结果表明甲醇三日内稳定。
8 实际样品检测
利用本方法，取具有代表性的化妆品基质样品47批次，11个品种（洗发露4批次、护发素4批次、沐浴露4批次、膏霜5批次、乳液5批次、化妆水5批次、花露水6批次、香水4批次、发胶4批次、面膜3批次、凝胶2批次），按照气-液平衡法和直接法进行测定，见表11。结果表明两种方法数据基本一致，方法使用。