为什么冷冻电镜 (Cryo-EM) 突然火了？是有什么技术突破吗？

臻

2015/05/13

私聊

冷冻电镜（Cryo-EM）

云昏无复影，冰合不闻湍：冷冻固定术

冰封一向是有效的保存手段，古今中外，概莫能外：曹操筑铜雀三台之冰井台，设计以储存冰块食物等；传媒大亨默多克冷冻精子，使随后降生的女儿获得数亿资产继承权；就连赛柏坦星人威震天都在冰里呆了9000多年。水结冰后会阻碍原先在溶液状态下快速的物质交换与扩散，低温使得化学过程速率降低：绝大多数代谢过程变得非常非常慢以至于我们难以察觉，这个技术叫做冷冻固定术(Cryo-fixation)。应用冷冻固定术，在低温下使用透射电子显微镜观察样品的显微技术，就叫做冷冻电镜（CryoEM）。冷冻电镜是重要的结构生物学研究方法，与之地位相当的另两种技术是X射线晶体学(X-ray crystallography)和核磁共振（NMR），这些方法都是为了获得生物大分子的结构以了解其功能。冷冻电镜，就是把样品冻起来然后保持低温放进显微镜里面，高度相干的电子作为光源从上面照下来，透过样品和附近的冰层，受到散射。我们再利用探测器和透镜系统把散射信号成像记录下来，最后进行信号处理，得到样品的结构。听起来很简单？在过去的一年半的时间里，冷冻电镜技术完成了自上世纪70年代以来最大的技术飞跃，很多结构生物学组集体转向冷冻电镜，不再吭哧吭哧的结晶了。就在上周，Nature上线了几乎是诺奖级别的冷冻断层成像论文，按照老板的话说：“任何放进显微镜的东西都成了金子，我这辈子从来都没有见过这样的景象。冷冻电镜的黄金时代真的来临了。”

图一：冷冻电镜工作原理，得到的照片信噪比较低
松迥月光先照鹤，寺寒沟水忽生冰：快速玻璃化
有些人可能读过雪中僵卧不须悲：液氮中的来生 - 随手干货解救战火知乎 - 知乎专栏是关于如何冷冻生物并且使之不变性的。简单的把样品冻起来只会让它在水结冰的过程中变形扭曲：冻过的肉味道可不怎么样。我们需要让水结成固体，但不是晶体的冰。在变成固体的过程中不能有大的形变。这种条件非常苛刻:谁能冻一罐未开封的可乐，易拉罐最后还不形变的？大实验室都采用冷冻机器人，能够控制点样时的湿度和温度，保证用特制滤纸擦过样品之后，残留的部分保持恒定，不会太厚也不会干掉，然后在封闭环境中以高速扎进用液氮冷却的液态乙烷中。这种方式的冷却速度如此之快，使得水分子还来不及转向就被固定在了原处，在数毫秒之内就完全冻好了。以这种方式制得的冰不是晶体，而是无定形态，在电镜下是透明的：玻璃也处于无定形态，玻璃化的名称由此而来。样品就镶嵌在无定形冰中，定在真实的一瞬。

图二：GroEL镶嵌在冰中
洛阳亲友如相问，一片冰心在玉壶：高性能显微镜
材料齐了，有个金刚钻是十分重要的。你知道一台最好的可以做冷冻电镜的透射电子显微镜需要多少钱吗？现在得450万美元。你还别嫌贵，这还只包括显微镜，不含什么电子探测器啦，球差矫正器啦，能量过滤器啦，相位板啦……全加起来保守估计600万美元，另加上每年数十万美元的仪器维护费:只有真的土豪才能负担的起。我们有全球第二台，中科院生物物理所有一台，清华有三台……土豪我们做朋友。显微镜贵，体现在以下几处优点：第一是加速电压高，电子能穿透厚样品。加速电压高导致显微镜巨大，我们必须挖开天花板，并且在地下最底层往下挖才勉强把它放进去。第二是透镜多，各种矫正，光线各种平行，球差各种小，相干度各种好。第三就是样品台稳定，其他组的破镜子每照一张之前需要10分钟稳定样品台（就是干等着），最好的20秒就足够，效率至少是30倍。第四就是全自动，自动换液氮，自动换样品，自动维持清洁，我在家里就能把砖搬了。听说最近国内一些地方准备花大价钱买，世界各处也在招人，希望等我毕业的时候还有些坑留着。

图三，房顶得被挖开。
心同野鹤与尘远，诗似冰壶见底清：高效率探测器
终于要到正题了，为什么过去一年半会有如此大的进展了：关键在于显微镜底部的电子探测器。目前常用的高级电子显微镜是300kV加速电压的，在300keV的电子的轰击下，大部分器件都会被打烂。在最新一代的电子探测器出现之前，我们使用电荷耦合器件（CCD），就是电子照下来要先打在荧光层上变成光信号，然后CCD再把光信号转成电信号生成图像。多余的一次光转换降低了效率。在冷冻电镜中，样品对电子剂量非常敏感，同一个地方看的时间长了就会被电子打爆，所以每个电子都非常的珍贵。最新的技术能够直接把电子抓下来，并且利用和超分辨荧光显微镜类似的技术来数电子，甚至可以对单个电子进行局部定位，把对比度提到了只在梦里才能想见的地步。因为这个探测器，许多以前不起作用的算法都能用了，看不见的蛋白质可以找到了，不用再一张一张的扫底片了。想买新的直接电子探测器？准备好100万美元，然后砍砍价。虽说是电子产品，但我觉得摩尔定律在这里不适用。
间关莺语花底滑，幽咽泉流冰下难：漂移矫正
一般来说，在拍摄某一样品的过程中，我们假设样品是不会自己动的:你拿相机拍运动的东西，曝光时间一长就会糊掉。冷冻电镜也有这个问题：电子束哗哗的穿过样品，这些无定形冰就会变软，变形，带着样品移动。因为无定形冰不是晶体，所以在外部强能流的影响下就会展现出些水的性质：这种流动虽然慢，却在电子显微镜下被万倍的放大，成为限制数据质量的大问题。有了高效探测器，我们可以把之前的1次曝光分解成30多次并且保证总电子量不变，由拍照片变成了拍电影，再把这些电影合并成一张近乎于完美的照片。就这样，冷冻电镜的拍摄技术达到了前所未有的高度。

图四：组里很久之前的结构，病毒相对好做。目前一般的蛋白，甚至是膜蛋白都能做到类似的程度。
这种技术有多疯狂？老板经常拿他的朋友Yifan举例，2013年一年可以发4篇nature正刊，一篇nature method，一篇cell，手下博士后直接去Harvard开始tenure track，北大生命科学院前院长饶教授发博文说是诺贝尔奖级别的工作。我们自己组里也有Cell, Nature, Science，大多是投了就中，很少被拒。实验室几个师兄开心的找教职，各大制药公司各种招会冷冻电镜的来测试新药可靠性，工作一点儿问题都没。
不要黑生科，我们是学物理和信号处理的。
作者：Hydro Ding，无各种良好嗜好看到好文忍不住想分享，如有冒犯，实在抱歉，可发站内信给我删除此文。
（来自互联网）

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