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第1楼2006/10/11
6. 操作容量(或交换容量)
在一定条件下,某种组分与基质(固定相)反应达到平衡时,存在于基质上的饱和容量,我们称为操作容量(或交换容量)。它的单位是毫摩尔(或毫克)/克(基质)或毫摩尔(或毫克)/毫升(基质),数值越大,表明基质对该物质的亲合力越强。应当注意,同一种基质对不同种类分子的操作容量是不相同的,这主要是由于分子大小(空间效应)、带电荷的多少、溶剂的性质等多种因素的影响。因此,实际操作时,加入的样品量要尽量少些,特别是生物大分子,样品的加入量更要进行控制,否则用层析办法不能得到有效的分离。
层析法的分类
层析根据不同的标准可以分为多种类型:
1. 根据固定相基质的形式分类,层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。纸层析是指以滤纸作为基质的层析。薄层层析是将基质在玻璃或塑料等光滑表面铺成一薄层,在薄层上进行层析。柱层析则是指将基质填装在管中形成柱形,在柱中进行层析。纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备,通常为一次性使用,而柱层析是常用的层析形式,适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。
2. 根据流动相的形式分类,层析可以分为液相层析和气相层析。气相层析是指流动相为气体的层析,而液相层析指流动相为液体的层析。气相层析测定样品时需要气化,大大限制了其在生化领域的应用,主要用于氨基酸、核酸、糖类、脂肪酸等小分子的分析鉴定。而液相层析是生物领域最常用的层析形式,适于生物样品的分析、分离。
3. 根据分离的原理不同分类,层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。
吸附层析是以吸附剂为固定相,根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术。
分配层析是根据在一个有两相同时存在的溶剂系统中,不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。
凝胶过滤层析是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相,根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。
离子交换层析是以离子交换剂为固定相,根据物质的带电性质不同而进行分离的一种层析技术。
亲和层析是根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力(如酶和抑制剂、抗体和抗原、激素和受体等),将某种配体连接在载体上作为固定相,而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种层析技术。亲和层析是分离生物大分子最为有效的层析技术,具有很高分辨率。
柱层析的基本装置及基本操作
目前,最常用的层析类型是各种柱层析,下面就简述柱层析的基本装置及操作方法,薄层层析的装置和操作将在后面详细讨论。
1. 柱层析的基本装置
柱层析的基本装置示意图如图3-3 所示:
2. 柱层析的基本操作
柱层析的基本操作包括以下一些步骤:
⑴ 装柱
柱子装的质量好与差,是柱层析法能否成功分离纯化物质的关键步骤之一。一般要求柱子装的要均匀,不能分层,柱子中不能有气泡等。否则要重新装柱。
首先选好柱子,根据层析的基质和分离目的而定。一般柱子的直径与长度比为1:10~50;凝胶柱可以选1:100~200,同时将柱子洗涤干净。
将层析用的基质(如吸附剂、树脂、凝胶等)在适当的溶剂或缓冲液中溶胀,并用适当浓度的酸(0.5N~1N)、碱(0.5N~1N)、盐(0.5M~1M)溶液洗涤处理,以除去其表面可能吸附的杂质。然后用去离子水(或蒸馏水)洗涤干净并真空抽气(吸附剂等与溶液混合在一起),以除去其内部的气泡。
关闭层析柱出水口,并装入1/3柱高的缓冲液,并将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中,使其沉降约3cm高。
打开出水口,控制适当流速,使吸附剂等均匀沉降,并不断加入吸附剂溶液。(吸附剂的多少根据分离样品的多少而定。)注意不能干柱、分层,否则必须重新装柱。
最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有2~3cm高的缓冲液,同时关闭出水口。(采用机械化装柱法在此省略。)
⑵ 平衡
柱子装好后,要用所需的缓冲液(有一定的pH和离子强度)平衡柱子。用恒流泵在恒定压力下走柱子(平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同)。平衡液体积一般为3~5倍柱床体积,以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。如果需要,可用兰色葡聚糖2000在恒压下走柱,如色带均匀下降,则说明柱子是均匀的。有时柱子平衡好后,还要进行转型处理。这方面的内容在离子交换层析中加以介绍。
⑶ 加样
加样量的多少直接影响分离的效果。一般讲,加样量尽量少些,分离效果比较好。通常加样量应少于20%的操作容量,体积应低于5%的床体积,对于分析性柱层析,一般不超过床体积的1%。当然,最大加样量必须在具体条件下多次试验后才能决定。
应注意的是,加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面,尽量避免冲击基质,以保持基质表面平坦。详细操作见层析实验。
⑷ 洗脱
当我们选定好洗脱液后,洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。
简单洗脱:柱子始终用同样的一种溶剂洗脱,直到层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大,其区带的洗脱时间间隔(或洗脱体积间隔)也不长,采用这种方法是适宜的。但选择的溶剂必须很合适方能使各组分的分配系数较大。否则应采用下面的方法。
分步洗脱:这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液,进行逐级洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。
梯度洗脱:当混合物中组分复杂且性质差异较小时,一般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的,梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH值等。最常用的是浓度梯度。在水溶液中,亦即离子强度梯度。可形成梯度的形式有三种,如图3-4 所示(以盐浓度梯度为例):
我们可以通过下式计算得到流经层析柱的洗脱液中盐浓度的计算公式:
C = CB - ( CB - CA ) ( 1 - V2 / V1 )B1 / A1
式中: C :流经层析柱的洗脱液的盐浓度
CB :梯度混合器中B 瓶的盐浓度(不搅拌)
CA :梯度混合器中A 瓶的盐浓度(搅拌)
B1 :B 瓶的横切面积
A1 :A 瓶的横切面积
V2 :流经层析柱的洗脱液体积
V1 :梯度洗脱液总体积
洗脱条件的选择,也是影响层析效果的重要因素。当对所分离的混合物的性质了解较少时,一般先采用线性梯度洗脱的方式去尝试,但梯度的斜率要小一些,尽管洗脱时间较长,但对性质相近的组分分离更为有利。同时还应注意洗脱时的速率。前面我们已经谈到,流速的快慢将影响理论塔板高度,从而影响分辨率。事实上,速度太快,各组分在固液两相中平衡时间短,相互分不开,仍以混合组分流出。速度太慢,将增大物质的扩散,同样达不到理想的分离效果。只有多次试验才会得到合适的流速。总之,我们必须经过反复的试验与调整(可以用正交试验或优选法),才能得到最佳的洗脱条件。还应强调的一点是,在整个洗脱过程中,千万不能干柱,否则分离纯化将会前功尽弃。
⑸ 收集、鉴定及保存
在生化实验中,基本上我们都是采用部分收集器来收集分离纯化的样品。由于检测系统的分辨率有限,洗脱峰不一定能代表一个纯净的组分。因此,每管的收集量不能太多,一般1ml-5ml / 管。如果分离的物质性质很相近,可低至0.5ml / 管。这视具体情况而定。在合并一个峰的各管溶液之前,还要进行鉴定。例如,一个蛋白峰的各管溶液,我们要先用电泳法对各管进行鉴定。对于是单条带的,认为已达电泳纯,合并在一起。其他的另行处理。对于不同种类的物质采用相应的鉴定方法,在这里不再叙述。最后,为了保持所得产品的稳定性与生物活性,我们一般采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩,再冰冻干燥,得到干粉,在低温下保存备用。
⑹ 基质(吸附剂、交换树脂或凝胶等)的再生
许多基质(吸附剂、交换树脂或凝胶等)可以反复使用多次,而且价格昂贵,所以层析后要回收处理,以备再用,严禁乱倒乱扔。这也是一个科研工作者的科学作风问题。各种基质的再生方法可参阅具体层析实验及有关文献。
转自清华课件