茶叶中菌落总数检测结果的测量不确定度评估

茶叶中菌落总数检测结果的测量不确定度评估

1. 概述
1.1测量依据：GB4789.2 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定。
1.2环境条件：温度(20±4℃)，相对湿度≤85% 。
1.3测量标准：无。
1.4测量对象：晒青毛茶、半成品茶、成品茶等。
1.5测量过程：茶叶中菌落总数的测量过程见图1。

1.6评定结果的使用：在符合上述规定条件下的测量结果，若在测量仪器和人员等实验条件稳定的情况下，可直接使用本不确定度的评定结果。

2. 评估模型

2.1菌落总数测量的计算
茶样经过处理，在恒温培养箱温度为36±1℃的条件下培养48±2h后，所得每g(mL)茶样中形成的微生物菌落总数。
假设菌落总数测量时，选定2个测定平行，则茶样单位体积的菌落总数y可由下式算出：
y = F·(N₁+N₂)/(V₁+V₂)……①
式①中：y—茶样单位体积的菌落总数； F—茶样稀释倍数(10的若干指数倍)；
N₁、N₂—培养基平板的菌落计算结果； V₁、V₂—吸取的茶样液体体积，均为1。
2.2菌落总数测量的数学评估模型建立
在2.1中，式①为理论公式，而在实际测量过程中，1)茶样稀释、2)菌落总数在培养基平板上出现的随机误差、3)人员查计菌落总数的误差、4)培养基的菌落生长率、5)计数平板上菌落的重叠、6)茶样的不稳定、7)同一样品多次平行测量重复性等均会对检测结果有显著影响，即引入了测量不确定度。
测量模型表示被测量(y)与各影响因子(x)之间的函数关系，一般通式为y = f(x₁,x₂, …, x_n)。因此，根据GB 4789.2建立茶叶中菌落总数测量的数学评估模型为：

y = f (R₁,R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇) ……②

3. 鱼骨图

由菌落总数测量的数学评估模型的建立，绘制出茶叶中菌落总数测量的鱼骨图，见下图2。其中T表示温度，Temperature；C表示校准，Calibration；其他符号或字母代表的含义见2.2中的解释说明。

4. 茶叶中菌落总数测量的相对标准不确定度分量的计算

由2.2可知菌落总数测量的的数学评估模型中7个不确定度分量相互独立，为方便不确定度运算，下面均以相对标准不确定度来表示各相应的不确定度。

4.1茶样稀释过程引入的相对标准不确定度u_rel(R₁)
对于菌落总数的测量，在茶样的稀释过程中，茶汤的逐级稀释(将1mL的茶汤原液稀释为10mL)对测量结果的影响最为显著，而在此步骤，以移液器吸取1mL茶汤对菌落总数测量结果的影响更大。其中，影响移液器移取茶汤的不确定度分量有两个，一个是环境温度T，另一个是移液器自身校准的不确定度C。现对不确定度分量u (T)和u (C)分析如下：
4.1.1环境温度引入的不确定度分量u(T)

根据供应商提供的资料，茶样稀释使用的移液器在20℃下校准。实验室的环境温度控制在20±4℃，而茶样的稀释溶剂为实验室用水，经查阅实验室用水的体积膨胀系数为2.08×10^-4(1/℃)，依据溶剂的体积膨胀效应，茶样稀释产生的体积变化为±（1×4×2.08×10^-4）mL=±8.32×10^-4mL，故a=±8.32×10^-4mL，假设其服从三角分布，u(T)=±3.40×10^-4mL。

4.1.2校准引入的不确定度分量u(C)

茶样稀释时使用的移液器量程为1mL，根据供应商提供的移液器校准证书，1mL移液器在20℃的体积(1±0.027)mL，故a=±2.7×10^-2mL，假设其服从三角分布，有u(C)=±1.10×10^-2mL。

由不确定度分量u (T)和u (C)，利用其不确定度的合成，可计算出茶样稀释过程引入的相对标准不确定度u_rel(R₁)= 1.10×10^-2。

4.2菌落总数在培养基平板上的随机误差引入的相对标准不确定度u_rel(R₂)

培养基计数平板上所查计的菌落总数均值是2个1mL所加茶样(茶样稀释匀液)中细菌经过分别培养出来的菌落总数均值。在一系列充分混匀的等量的粒子悬液(1mL茶样稀释均匀液)中粒子(细菌)数的随机性服从泊松分布(Poisson scatter)，所以菌落总数(均值)在培养基平板上的随机误差的不确定度可用泊松分布来表示，其相对标准不确定度u_rel(R₂)为均值的倒数。

实验室茶样的2个测定平行，茶样单位体积的培养基平板菌落计算结果为N₁=47，N₂=33，即可算出u_rel(R₂)= 2.25×10^-2。

4.3人员查计菌落总数引入的相对标准不确定度u_rel(R₃)

测定(检测)人员在查计培养基平板上的菌落时，因经验和计数平板上菌落的复杂培养结果等而出现误差，该误差通过对同一个培养基平板的菌落进行多次计数后统计得出，采用贝塞尔公示u_rel(R₃)=计算，试验数据详细见下表1。u_rel(R₃)= 8.717×10^-3。

表1同一个培养基平板的菌落进行多次计数

因菌落总数测定所用的培养基为非选择培养基，经查阅文献其菌落生长率PR≥0.7，故其误差范围可计算1-0.7=0.3，其服从矩形分布，即培养基的菌落生长率引入的相对标准不确定度u_rel(R₄)=0.1732。

4.5计数平板上菌落重叠引入的相对标准不确定度u_rel(R₅)

菌落总数在培养基平板上生长常出现重叠情况，且重叠情况随平板上菌落总数的增多而增多。据相关文献，对于计数平板上菌落重叠引入的相对标准不确定度u_rel(R₅)可直接取0.05，即u_rel(R₅)= 0.05。

4.6茶样不稳定引入的相对标准不确定度u_rel(R₆)

待测茶样的不稳定实际为其中细菌的不稳定。受茶样特性、细菌本身特性和样品存储条件的的影响，样品在受理之后测量之前，其中细菌会发生数量变化，即引入不确定度。通常情况下，茶样中菌落总数的变化范围为±20% ，且茶样中细菌的变化常服从矩形分布。因此茶样不稳定引入的相对标准不确定度u_rel(R₆)=0.1155。
4.7多次平行测量重复性引入的相对标准不确定度u_rel(R₇)
菌落总数的测量，按照GB 4789.2 对同一茶样进行10个平行测量，所得结果见下表2。

表2 同一茶样的菌落总数测量数据

5. 合成标准(相对)不确定度

6. 茶样中菌落总数测量的不确定度表示

当p=95%时，包含因子k=2，则扩展不确定度：
U(N)=k·u(N)=2×10.53696cfu/mL
=21.0739 cfu/mL。

7. 菌种测量不确定度评估过程的讨论

7.1菌落总数测量的主要不确定度分量解析
菌落总数测量的不确定度主要来源于培养基的菌落生长率[ u_rel(R₄)]、茶样(主要指茶样中的细菌)的不稳定[ u_rel(R₆)]、菌落总数在培养基(因培养基平板上的菌落数多少而异) 平板上的随机误差[ u_rel(R₂)]和茶样多个平行测量的重复性[ u_rel(R₇)]；其次来源于菌落总数在培养基平板上的重叠和测量人员查计菌落数的误差；再次，来源于样品的稀释。在称量器具、培养箱条件等符合GB 4789.2标准的前提下，加茶样(指溶解茶叶的母液或培养营养液)的体积和茶样称量等引入的不确定度可通过规范操作加以避免而可忽略。

7.2 菌落总数测量是间接测量
菌落总数测量不是直接测量，其测量结果是由文中公式①换算而来，不像天平称量、尺子丈量和仪表测量等直接测定得到结果。故把菌落总数测量当做直接测量而将测量的数学模型写为y=x是不合理的。

7.3 关于多次测量同一样品而评定不确定度

有相关文献提出，对同一样品重复测量多次，计算菌落总数测量结果的算术平均值及标准差，从而计算测量结果的不确定度。这是不符合实际工作的。

7.4 关于合并不同样本的标准差而评定某个样品的不确定度

有文献把不同样品的菌落数测量结果混到一起算出所谓的合成标准偏差，进而把该标准偏差，当作其中任一样品菌落数测量结果的标准不确定度; 有了新的测量结果，可随时作为合并样本标准差计算的输入，即可随时将新样品的测定测量与以往样品的测量结果混到一起算出标准偏差而当作新样本测量结果的标准不确定度。

从统计学上讲，合并样本标准差的计算是有前提条件的。该前提条件是，所有被合并计算的样本测量结果都是在规定条件(测量重复性条件或测量复现性条件或期间测量精密度条件)下对同一或类似被测对象的重复测量的结果，同时样品测量的目标含量应该稳定和接近。