新型的DNA合成柱

逗点生物

2015/07/09

私聊

其他仪器综合讨论

新型的DNA合成柱

技术领域
基因合成、引物合成工具或者耗材。

背景技术
随着分子生物学技术的发展，包括药物研发、遗传病和感染性疾病诊断、基因研究、聚合酶链式反应(PCR)和杂交试验都需要大量的DNA片段，这些DNA片段大都需要人工合成。DNA合成的片段常常有不同的表述方法，比如寡核苷酸、PCR引物、接头、探针、短链引物和长链引物等。

DNA合成过程简述如下，（注：此种方法一般合成短链的DNA，通常<20bp，少数长度可达150bp）
第一步是将预先连接在固相载体上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基。
第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在后续环节根据实验需要来选择纯化方式分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体（通常是CPG）的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC、PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩，脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据要求分装。

全基因合成。全基因合成是在短链DNA的基础上，拼接而成。具体方法为，将双链基因分成若干短链DNA片段，每个片段长度控制在40～100个碱基，并使每对相邻互补的片段之间有大约6个碱基交叉重叠。在体外去除基因两端末端外的所有片段磷酸化。混合退火后加入DNA连接酶，即可得到较大的基因片段。
要完成DNA合成，除需要DNA合成仪外，还需要DNA合成柱和合成试剂，试剂包括乙腈等流动相以及核苷酸单体等。
经典的DNA合成柱，包含固相载体、筛板和空柱管。固相载体通常用控制孔径的玻璃球（Controlled Pore Glass，简称CPG），CPG球体内部有很多不规则的孔道，孔道的大小称为孔径，通常选择孔径500A和1000A的CPG用于DNA合成，也可以选择其它孔径。筛板通常用UHMW-PE或HDPE粉末烧结而成。UHMW-PE粉末在一定的温度下处于半融化状态，颗粒之间搭桥形成一定的孔径。在DNA合成中，筛板的作用是阻挡CPG不漏下来而合成试剂能够通过。空柱管为聚丙烯注塑而成。

新型的DNA合成柱由CPG Frits和空柱管构成。CPG Frits是CPG和UHMW-PE或HDPE粉末烧结成。UHMW-PE颗粒包裹并固定CPG颗粒，UHMW-PE颗粒之间搭桥形成一定的孔径。流动相在CPG内部的孔和UHMW-PE颗粒之间的孔中流动，完成各种化学反应。CPG Frits 直径3.9mm，厚度为6mm、9mm和12mm。CTGen公司推出的CPGFrits，直径为3.9mm，厚度/合成量为5.5mm/200nmol，4.0mm/100nmol和2mm/25nmol。

和经典的DNA合成柱比较，CPG Frits合成柱是一个进步。经典的DNA合成柱只适合短链引物合成（<30bp），杂带多，合成引物纯度低。CPG Frits合成柱合成的引物长度增加（40-150bp），引物纯度高，无杂带，操作方便、合成效率高、通量大、质量优，适合于自动化生产，节约成本，加速基因合成，缺点是产率比经典的DNA合成柱低。
和经典的DNA合成柱比较，CPG Frits还可以节约合成试剂。经典的DNA合成柱试剂容纳试剂的空间较大，而CPG Frits只有孔隙的体积是容纳试剂的体积。孔隙包括CPG内部的孔和UHMW-PE颗粒之间的孔。CPGFrits的孔隙率在40%左右。
随着基因药物筛选、基因功能研究、蛋白组研究的进展，需要海量的短链DNA合成以及拼接成长链全基因，基因的快速合成成为热门。对CPG Frits合成柱提出了新的功能需求：1、合成量低，最好在1-25nmol；2、节省试剂，合成成本低；3、环保；4、错配率低；5、合成速度快；6、可靠性高。
现行的CPG Frits及其空柱管，并不完全符合以上新的功能需求，有很多缺点，具体表现在如下几个方面。
第一，目前的CPG Frits设计主要为常量DNA合成设计，比如>100nmol。主要用于常规PCR引物合成。不适合做1-25nmol，甚至更低合成量的的DNA合成。
第二，目前的设计，没有优化试剂的使用量，不环保，成本高。试剂的使用量和CPG Frits的内部孔隙有关。具体地说，在孔隙率在40%左右基本固定时，CPGFrits体积越大，孔隙越大，使用的试剂量越大。使用的试剂，特别是核苷酸单体，是DNA合成的主要成本构成之一，导致成本上升。使用的流动相比如乙腈，清洗的体积减少，更加环保。在合成量少时，表现不突出，如果年合成量在数百万条引物，差别将非常大。
第三，目前CPG Frits的结构设计也有很多缺点。主要表现在：
其一，CPG Frits的直径太大，不利于降低总体体积。减少直径是减少体积的最有效方法，选择更小的直径比如3mm，在同样的高度下体积比直径4mm的滤芯差不多降低1倍。现行的CPG Frits直径在4mm左右。
其二，没有考虑到CPG Frits厚度对合成的影响。为了减少CPG用量，在CPG和UHMW-PE的比例不变的情况下，现行的方法是减少CPG Frits的厚度。这样的做法使流动相在CPG Frits中的流道缩短。试剂和CPG反应的接触时间减少，可能导致合成错误率提高。
其三，没有考虑自动化装配。CPG Frits需要足够的厚度/直径比，才可以方便全自动装配机的传感器识别方向，实现全自动装配。现行的CTGen公司的直径3.9mm，厚度4.0mm的CPG Frits是很难实现自动化装配的。
其四，空柱管的结构设计也有很多缺点，主要表现在没有考虑装配精度。为了退模方便，方便注塑，空柱管的内壁是斜度设计，管子的CPG Frits装配位内径上口大、下口小。CPG Frits 烧结时会收缩，并且批次之间会有差异，导致对CPG Frits的压缩率不一样，进一步导致液体通过的阻力差异大。当差别较大时，会有穿孔现象，即当个别柱子已经抽干，其它柱子的流动相没法再抽干。

实用新型内容
为了方便微量的DNA合成，节省试剂，降低成本，增加环境友好性，本实用新型公开了一种DNA合成柱，具体技术方案如下。
一种DNA合成柱，由CPG Frits和空柱管构成，其特征在于，CPG Frits的直径<3.5mm，优选的直径在1.5-3.1mm。这样的设计使CPG Frits的体积减小约1倍以上。DNA的合成量极大地减少。CPG Frits的厚度>2.0mm，优选的厚度为2.5-4.5mm。这样的设计使试剂的流道足够长，增加化学反应的时间以及接触反应的机会，降低潜在的合成错误。CPG Frits的厚度>直径0.5mm以上，优选>1mm。足够的厚度/直径比，可以方便全自动装配机的传感器识别方向，实现全自动装配。空柱管采用梯度直口设计，即在空柱管留多个内径梯度减小的CPG Frits装配位，内径梯度减小的数值为0.01-0.09mm，优选为0.05mm。装配位的数量优选为2-5个装配位。每个装配位都是标准的圆柱体，没有斜度，每个装配位的高度大于CPG Frits的厚度，不同的装配位内径梯度减小，以5个装配位、内径梯度减小的数值为0.05mm为例，各装配位内径分别为：
第1装配位内径=CPG Frits的理论直径；
第2装配位内径= CPG Frits的理论直径－0.05mm；
第3装配位内径= CPG Frits的理论直径－0.10mm；
第4装配位内径= CPG Frits的理论直径－0.15mm；
第5装配位内径= CPG Frits的理论直径－0.20mm。
经过逗点生物设计，主要有两款DNA合成柱，具体方案如下。
一种DNA合成柱，由CPG Frits和空柱管构成，其特征在于，CPG Frits的直径为3mm，厚度为4mm，空柱管留4个CPG Frits的装配位，每个装配位都是标准的圆柱体，第1装配位内径为3.00mm; 第2装配位内径为2.95mm; 第3装配位内径为2.90mm和第4装配位内径为2.85mm，每个装配位的高度为5mm。
一种DNA合成柱，由CPG Frits和空柱管构成，其特征在于，CPG Frits的直径为2mm，厚度为3mm，空柱管留4个CPG Frits的装配位，每个装配位都是标准的圆柱体，第1装配位内径为2.00mm; 第2装配位内径为1.95mm; 第3装配位内径为1.90mm和第4装配位内径为1.85mm，每个装配位的高度为4mm。
本实用新型的DNA合成柱，专为DNA合成量在1-50nmol/次而设计，优选的合成量在5-25nmol。和现有的CPGFrits比较，优势如下：
1、省试剂、节约成本
按照UHMW-PE粉烧结滤芯40%的孔隙率计算，直径4mm高度4mm CPG Frits 体积为50.24L，能容纳试剂的体积为50.24*40%=20.096L；直径3mm高度4mm CPG Frits体积为28.26?L，能容纳试剂的体积为28.26*40%=11.304L；直径2mm高度4mm CPG Frits体积为12.56L，能容纳试剂的体积为12.56*40%=5.024L。
作为DNA合成反应的主要载体，试剂流过CPG Frits柱体，直径3mm比直径4mm节省近一倍的试剂用量。同样地，直径2mm比直径4mm节省近4倍的试剂用量，从而使合成成本极大地降低。
2、高效率，节约时间
采用直径3mm高度4mm CPG Frits作为引物合成的载体，由于体积小，能够将CPG含量降到最低，仅为0.5-1mg，而直径4mm高度4mm CPG Frits，CPG含量则高达5-6mg，高的CPG含量，高的底物浓度，必然增加参与反应的试剂的量与反应时间，特别是偶合反应的时间，将大大延长。采用直径3mm高度4mm CPG Frits作为引物合成的载体，偶合时，单体用量仅为15-20L，耦合时间在30秒内完成，从而缩短了整个合成的时间。
3、适合于更小规格合成
直径4mm高度4mm 的CPG Frits，往往CPG含量高，通常用作100nmol、150nmol和200nmol等规模合成，试剂用量大、合成成本高，产量高，通常达到20OD以上，适合传统的PCR引物合成。近年来，由于合成生物学的快速发展，基因的快速合成成为热门，然而用于基因合成的引物，对其有着严格的要求：链长、突变率低、杂带少、高通量，CPG Frits的出现则弥补了传统引物合成的不足，为基因的快速合成奠定了坚实的基础，然而用作基因合成的引物，对产量没有太大的要求，往往0.5OD就可以完成基因的合成。合成量多了，往往造成资源的浪费，甚至环境的污染。如何研发更小规模的微量合成，成为引物合成的一个瓶颈，采用小直径 CPG Frits作为引物合成的载体，可以将合成规模降低到25nmol甚至1nmol的合成规模，极大的降低了试剂用量，节约了资源，保护了环境。
4、产品纯度高、突变率低、链长
采用直径3mm高度4mm ，甚至更低直径的CPG Frits作为引物合成的载体，由于CPG含量低，添加脱保护剂（三氯乙酸为强酸）仅需1次，15秒便可完成，而直径4mm高度4mm 的CPG Frits一般需要2次完成，合成的链越长，接触脱保护剂的机会也就越多，越容易造成引物突变-脱嘌呤现象。采用直径3mm高度4mm CPG Frits作为引物合成的载体，不仅提高了合成效率，而且降低了引物的突变率，使突变率远低于千分之二的国际标准，并且提高了产品的纯度，使合成产品长度达到80bp以上。