说说凝胶色谱维修那些事儿

lu_sunshine

2015/07/14

私聊

凝胶色谱（GPC）

说说凝胶色谱维修de那些事儿

随着凝胶色谱GPC/SEC设备的升级，多数实验室已经或者正在用更先进的多检测器系统取代相对传统单一的视差检测系统。但实验者得到更全面更接近研究对象真实分布的信息同时，对新系统的性能和维护保养产生了一些担心，甚至有的实验者异口同声的发出了这样的判断：新系统检测器多，更容易出问题。对于此，笔者有不同的看法，本文通过几个例子来揭示事实的真相。还请各位实验室高手听笔者慢慢道来。

首先，我们有必要明确一些基本概念，从而制定实验规范，提高仪器使用率。正如，想让你的马儿日行千里必须给他日行千里的口粮一样。我们需要做好实验准备，才不会事倍功半，徒劳一场。
众所周知，GPC/SEC是液相色谱的一个分支。那么，在选择流动相时一定要按照HPLC级的要求选择溶剂，配置的流动相达到仪器运行的基本要求。即多检测器对流动相的要求，增加了检测器之后，每个新检测部分都有新的要求。一定要做好实验前的准备工作，仪器处在较理想的实验条件下，才能事半功倍。本文力图通过讲述两个仪器故障维修小故事，来充分剖析故障原因，从而提高操作者对仪器性能的掌握，建立合理的实验室操作规则。
第一个故事：由氘灯不亮引发的连锁反应

某高校实验室的GPC配置为自动进样器和UV,RI,VIS,LS(RALS/LALS)四检测器联用，系统运行了4年，常用流动相为THF。最近更换流动相为DMSO，由于寒假的原因，停用了近2个月。重新开机，UV检测器自检不能通过，提示氘灯点不亮。见图一：

图一： Deuterium lamp don’t start! 图二：Standby-key

仪器背景了解：
UV检测器的灯源是一个消耗品，提供了紫外区190-490纳米的稳定光源，使用寿命约2000小时。所以仪器设计者在前面板添加了一个standby按钮，图二所示。当仪器不做样品时，按住3秒钟，即进入节约光源模式。增加光源的有效使用寿命。

原因解析：
1使用者在不操作实验时，仍点亮氘灯，不进入standby节约模式；

解决问题：
更换氘灯灯源

得到的启示：
掌握仪器的操作技巧，延长使用寿命，节约维护成本。
但是，这个故事还远远没有结束，接下来的事实令人惊讶：在更换完氘灯，新问题出现了，请看左侧表格：

新问题	解决情况
A，GPCmax泵后,Filter损坏；	订filter和管路，螺母，螺箍
B，LALS信号低； UV信号噪声大；	清洁光柱，调节激光光路；订转接板更换，信号正常；
C,做DMSO体系GPCmax进样针损坏； Wash needle时有气泡：	订500ml针更换；进样正常；加固六通阀PTFE管路，正常；
D,Vis中的DP信号差；更换溶剂后气泡多，IP,DP信号都有波动；	对溶剂做超声处理，气泡减少，但DP噪声还是较大；
E,DP跳动大于2mv小于5mv，其波动和IP大体一致；其值在-500到500mv之间；	逐步排除气泡，柱后气泡排除干净；维修脱气机密封部件；添加Pneumatic Pulse Damper；
F,IP值一直升高，且有波动；	重新做分流比管路，调整比例正常；50-60%流速到黏度的IP，40-60%流速到RI检测器；
G,泵系统不稳定，出峰保留体积变化	做泵的PM保养，系统稳定性能提高，试验结果符合指标。

原因故障分析：

1、仪器环境没有做清洁。往往仪器进入实验室的同时，就到了无人监管的污染环境中；所以出现了表中的问题A,G；
2、试验条件限制。
在寒假前的项目中，用到了DMSO体系。注意，DMSO体系与THF系统的不同：凝固点的不同，DMSO在低于16°C时便会凝结，溶剂的黏度就会增加，所以出现了表中问题C，F，G；
3、根据不同体系，提前做系统的PM维护。
当您使用的体系发生改变时，请一定仔细查阅使用说明中的warming，做好相应的前期准备。必要时，请厂家工程师做PM！
4、请注意条件的改变给系统带来的变化。
请明确故障发生时是哪个条件发生了变化！
这个故事希望可以让大家理解：一个明显故障的存在，可能是其他故障反映。我们怎么做才能彻底解决问题，或者怎么才能避免这样的连锁反映呢？
第二个故事：仪器数据变化是找到仪器故障的钥匙

很多实验者尤其是没有特定管理员的实验室，往往发生这样的抱怨：“我们什么也没有动，仪器就出故障了”。我相信，我们都是无神论者，事实的发生总会有原因这需要我们通过数据来寻找蛛丝马迹：

某大型企业研发实验室，由于每个人负责的项目比较多。相应的仪器设备也比较多，当项目来时，往往仪器也会出问题。为什么呢？
在没有实验时，仪器处在Idle状态，是低速模式。项目来了，需要马上进行实验。这是一个是需要唤醒它，使之进入战斗状态即Run的模式。那么这个换相过程需要注意：一定是在低流速下开始，按照阶梯流速，缓慢的变化到实验条件。并且每个流速下，必需达到3-5个柱体积，才能切换到下一个更高的流速。下面是一个例子，仪器系统是一个包含VIS黏度，LS光散射检测器的多检设备。报修说是泵漏液，但是，完成泵头PM维护压力值正常之后，实验者却看到的光散射信号为负值，IP值为0mv。那么，我们可以通过查找数据文件，看看是什么时候发生变化，到底出现了什么故障：

IP值变化： RALS 和 LALS信号变化：

图一：IP值29.0mv 正常值在200mv左右；
图二：17mv，噪音突然增大，超出正常值十倍以上；
图三7mv；已经降到接近于0mv
图四中的0mv， LS信号为负值，开关laser无变化
从以上数值的变化说明了什么呢？

图一是仪器正常状态下的数值，注意此时的IP值是29mv，此时的日期是2015-05-14。图四中IP值为0mv，说明检测器已经由漏液发生，并且很严重。LS值为负值，并且开关laser无任何变化；说明光路已经堵塞此时的日期是2015-05-23。已经排除laser本省损坏。图二中LS噪音突然增大，说明仪器体系发生了较大变化。也就是说在2015-05-14到2015-05-23期间一定发生了什么操作，引起了仪器的变化。经过再三和实验者的沟通，才最终明白是在5月20号开始系统开始换相到5月21号开始低流速运行，到5月23号流速设定到实验值。那么问题很清楚，在换相过程中，因为压力过高，LS的流通池发生了渗漏，起初是渗漏，现在到了彻底崩溃的状态。表面上是压力高，泵漏液了。其实，检测器内部也发生了巨大变化。不得不更换更多配件了。

这个故事说明，外部的一些微小的变化预示着内部可能发生了巨大变化！请耐心的告诉自己仪器发生了哪些变化，这些变化是由什么引起的。尤其注意和原来不一样的地方！
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第三个故事：区别不同的 purge操作
对于整个 GPC/SEC 系统来说，日常维护中不可缺少的一项操作就是 purge，purge 在英文字典的意思是 vi. 净化；通便，vt. 净化；清洗；通便。我们更愿意理解成灌注充满，使气泡排除干净。但是由于不同的部分，purge的方法不一样。以至于，有的时候我们说要 purge时，操作者一头雾水。一个有趣的故事是，RI 检测器在换相后要 purge 3-5 次，每次 5-10 分钟。有个实验员竟然告诉我说，purge了12个小时，基线还是一直 drift。其实他只是点击了一次按钮，实际情况只做了一次 5mi的 purge。那么我们怎样才能做好 purge呢？希望通过下面的表格可以做些了解和区分：
种类流速时间/频率备注

注意：
purge 操作一定是在进样前进行，分泵和检测器两种。目的是得到稳定的基线和峰型！
这个故事会告诉您，我们不仅要知道仪器的某项功能，还要知道这样操作的目的，学会自己来判断标准，怎么来做才是最佳选择。

总结：
任何问题的出现，总会有其发生的根源。我们需要做的是仔细回忆我们对仪器做了什么，认真观察仪器发生了什么变化，耐心分析这些变化的原因找到解决的途径。

并且是否可以考虑实验开始前，我们做一些力所能及的事情，形成实验室操作守则：

1，样品的性质，是否可以查找到相关文献了解样品性质确认相关体系；
2，做样品溶解，怎么过滤，尽量除去不容物。保证目标物的准确浓度；
3，准备色谱级溶剂，添加合适种类的缓冲盐，并且计算合适的浓度，过滤并且除去气泡；
4，检查仪器系统是否正常运行，压力，流速，基线等是否符合指标；
5，日常维护中应该注意观察的指标：IP值，系统压力值，各光源是否正常开关；
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前期准备工作是您实验顺利进样的坚实基础，希望我们用做科研的精神和态度来呵护对待我们的帮手---实验室仪器之一 SEC/GPC。
任何问题的出现，总会有其发生的根源。我们需要做的是仔细回忆我们队仪器做了什么，认真观察仪器发生了什么变化，耐心分析这些变化的原因找到解决的途径。

希望我们用做科研的精神和态度来呵护对待我们的帮手---实验室仪器之一SEC/GPC。

附件：

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