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只要方法得当，再复杂的样品都不怕

jhjs

2015/08/03

私聊

兽药/抗生素检测

只要方法得当，再复杂的样品都不怕

磺胺类药物：是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一大类药物的总称，常被用于临床预防和治疗细菌感染性疾病的化学药物，其抗菌谱较广, 是一种广谱抗菌药，对大多数革兰阳性菌以及革兰氏阴性菌有抑制作用。
磺胺类药物有很多明显的优点，如性质稳定、品种多、造价低、使用简便、容易生产等。在畜牧养殖业中常被用于饲料添加剂或动物疾病治疗药物普遍应用。
磺胺类药物在动物体内也不是越多越好，尤其是吃了使用过该类药物的动物的人，常会被引起过敏性反应，且可能致癌，严重的影响了我们的身体健康和生活水平。在严峻的形势面前，社会各界高度重视，各种检测方法油然而生，以下就是比较完美的一种。
本方法参考农业部958号公告-12-2007制定，规定了水产品中13种磺胺类药物残留的测定方法：液相色谱-紫外检测法。
本标准规定了水产品中磺胺嘧啶（sulfadiazine）、磺胺噻唑（sulfathiazole）、磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine）、磺胺5-甲氧嘧啶（sulfameter）、磺胺二甲基嘧啶（sulfamethazine）、磺胺甲氧哒嗪（sulfamethoxypyridazine）、磺胺氯哒嗪（sulfachlorpyridazine）、磺胺6-甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine）、磺胺甲基异恶唑（sulfamethoxazole）、磺胺多辛（sulfadoxine）、磺胺异恶唑（sulfafurazole）、磺胺二甲氧哒嗪（sulfadimethoxine）、磺胺喹恶啉（sulfaquinoxaline）残留量的测定。
我们结合农业部958号公告-12-2007，及实验室具体情况，制定了本实验室的检测方法。下面仔细看。
实验原理
准确称取适量样品，前处理后由进样器进样，通过色谱柱分离，紫外检测器检测，保留时间定性，峰面积定量，计算出结果。
仪器及试剂
1.仪器
高效液相色谱仪（作为检测器+二元梯度泵+柱温箱）；电子天平（万分之一级别的）；溶剂过滤器；超声波清洗仪；均质机；旋涡震荡器；离心机；恒温水浴仪；固相萃取装置等等。
2.试剂
乙酸乙酯（优级纯）；无水硫酸钠（分析纯）；乙酸（分析纯）；甲醇（色谱纯）；正已烷（优级纯）；超纯水；乙腈（色谱纯）等等。
试样处理
1.样品制备
虾，去头，去壳，去肠线，取肌肉部分；样品切成不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块后混合。
2.提取
将样品解冻，称取5.00g，置于50ml玻璃离心管。然后加入25ml乙酸乙酯，超声1min，加入5g无水硫酸钠，均质机14000r/min均质1min，旋涡混合1min，3000r/min离心10min，将乙酸乙酯层小心转移到100ml梨形瓶中，再向原离心管中加入25ml乙酸乙酯，旋涡混匀1min，3000r/min离心10min，将乙酸乙酯合并于100ml梨形瓶中，于30℃水浴中减压浓缩至近干。
3.净化
先用1ml甲醇溶解上述残渣，再加入1%2ml乙酸溶液，旋涡混匀，超声1min，转移到新的50ml玻璃离心管中，再向梨形瓶中加入1ml甲醇和2ml1%乙酸溶液，旋涡混匀，超声2min，转移到50ml玻璃离心管中。向玻璃离心管中加入8ml正已烷，旋涡混匀，3000r/min离心5min，弃上层正已烷层，再加入8ml正已烷重复操作1次，下层加水6ml稀释，HLB（3ml）固相萃取柱分别先用3ml甲醇和6ml水处理，处理完毕后，加入试样稀释液，再用3ml水和2ml5%甲醇淋洗，最后用10ml甲醇洗脱，洗脱液在30℃减压浓缩至干，用1ml流动相（乙腈+甲醇+2%乙酸溶液=5+10+85）定容，经0.45um微孔滤膜过滤，供液相色谱测定。
色谱条件
检测器：紫外检测器
色谱柱：Promosil C18，4.6 X 250mm，5μm
柱温：40℃
流动相：乙腈、甲醇和2%乙酸溶液
流速：0.6mL/min
检测波长：270nm
进样量：20μL
梯度洗脱表如下：
以下是农业部958号公告-12-2007流动相梯度表，一看这个表就知道，这个方法至少需要三个高压泵，比较麻烦。

通过分析和实验，我们采用了以下流动相梯度表：

标准品色谱图：

样品（某特意喂养的虾）色谱图：

色谱峰从前向后依次为磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺5-甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺6-甲氧嘧啶、磺胺甲基异恶唑、磺胺多辛、磺胺异恶唑、磺胺二甲氧哒嗪、磺胺喹恶啉。
分析步骤及方法验证
1. 标准曲线
将13种磺胺类药物标准中间液，用流动相稀释成标准工作液，取20ul进样，以峰高为纵坐标，以标准品中磺胺浓度为横坐标，绘制工作曲线。
2. 色谱分析
分别取标准品和样品各20ul进样，记录峰高，响应值均应在仪器检测的线性范围之内，根据标准品的保留时间定性，外标法定量。
3. 结果计算
样品中荒；磺胺类药物残留量按照公式（1）计算，
式中：

X——样品中磺胺类药物的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；
C——样品提取液中磺胺类药物的浓度，单位为微克每升（μg/L）；
V——最终定容体积，单位为毫升（mL）。
m——样品质量，单位为克（g）

4. 验证项目
a. 适用的浓度范围和样品基体
磺胺标准工作液的浓度为：分别准确量取标准中间液适量，用流动相稀释成标准工作液，浓度分别为：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺5-甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺6-甲氧嘧啶、磺胺甲基异恶唑、磺胺多辛、磺胺异恶唑、磺胺二甲氧哒嗪（0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL）；磺胺喹恶啉（0.02μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL）；
样品基体：虾
线性方程：
磺胺嘧啶线性方程为：y=0.04194x-0.018001 ，R2=0.9993
磺胺噻唑线性方程为：y=0.063594x-0.023432 ，R2=0.9990
磺胺甲基嘧啶线性方程为：y=0.065969x-0.071324 ，R2=0.9991
磺胺5-甲氧嘧啶线性方程为：y=0.066368x-0.044370 ，R2=1.0000
磺胺二甲基嘧啶线性方程为：y=0.061353x-0.048579 ，R2=1.0000
磺胺甲氧哒嗪线性方程为：y=0.054948x+0.027413 ，R2=1.0000
磺胺氯哒嗪线性方程为：y=0.043806x+0.067603 ，R2=0.9997
磺胺6-甲氧嘧啶线性方程为：y=0.041440x+0.080984 ，R2=0.9996
磺胺甲基异恶唑线性方程为：y=0.043170x+0.018463 ，R2=0.9996
磺胺多辛线性方程为：y=0.036971x+0.016300 ，R2=0.9995
磺胺异恶唑线性方程为：y=0.041563x+0.090825 ，R2=0.9995
磺胺二甲氧哒嗪线性方程为：y=0.059375x +0.011490 ，R2=0.9993
磺胺喹恶啉线性方程为：y=0.030460x+0.013208 ，R2=0.9992

磺胺类物质：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺5-甲氧嘧啶、、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺6-甲氧嘧啶、磺胺甲基异恶唑、磺胺多辛、磺胺异恶唑、磺胺二甲氧哒嗪在0.01mg/L～1.0mg/L范围内线形良好；磺胺喹恶啉在0.02mg/L～2.0mg/L）范围内线形良好；
b. 检出限实验
检出限：将磺胺混合标准中间液，逐级用流动相稀释，并取20ul进样，记录色谱图，取S/N=10时的溶液浓度，计算方法的检出限。
S/N=10时浓度分别为磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺5-甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺6-甲氧嘧啶、磺胺甲基异恶唑、磺胺多辛、磺胺异恶唑、磺胺二甲氧哒嗪（0.05μg/mL）；磺胺喹恶啉（0.10μg/mL）。
参照公式（1）计算样品检出限：
磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺5-甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺6-甲氧嘧啶、磺胺甲基异恶唑、磺胺多辛、磺胺异恶唑、磺胺二甲氧哒嗪（10μg/kg）；磺胺喹恶啉（20μg/kg）
c. 精密度实验
参照（4.3）样品处理方法，称取5.00g样品，置于50ml玻璃离心管中，精密加入0.5ml（1ug/ml）标准使用液，然后加入25ml乙酸乙酯，超声1min……。
重复处理6次，分别各取50ul进样，记录色谱图，计算各6次测量的相对标准偏差。

d. 方法回收率测定（准确度）
参照（4.3）样品处理方法，称取5.00g样品，置于50ml玻璃离心管中，精密加入0.2ml（1ug/ml）、0.5ml（1ug/ml）、1.0ml（1ug/ml）标准使用液，然后加入25ml乙酸乙酯，超声1min……。
上述三个浓度每个浓度重复3个样品，分别各取50ul进样，记录色谱图，计算样品的回收率情况。

怎么样，还不错吧？大家都知道样品越复杂检测难度越大，各组分很难完全分离（分离度），这个样品共包含13种物质，这在液相色谱中是非常复杂的检测了。更重要的是我们通过努力优化（简化）了分析方法（主要是改变了梯度表和进样量），得到了比较完美的结果。
样品很复杂，检测结果很理想，检测方法适当、适用。
检测一是检测，二是学习，通过现有条件，适当优化检测方法，在检测中学习和锻炼，既完成了工作又学到了知识，何乐而不为呢！

分
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