HPLC分析中常见问题④——峰形变差篇

峰形篇

一、所有色谱峰均出现肩峰、裂峰
（1）填料发生坍塌或损坏→很难恢复，建议更换新色谱柱
（2）出现杂质吸附的情况→可以按小流速在高水相条件长时间冲洗，然后继续使用高有机相进行冲洗；或者使用H₂O : CH₃CN = 1: 1，H₂O: CH₃OH = 1 : 1条件进行长时间冲洗。冲洗后重新测定柱效来判断色谱柱是否可以继续使用。

如上图所示，对这2支色谱柱分别进行柱效测定，发现所有色谱峰均出现了裂峰现象；
进而打开入口端查看填料，发现填料均已出现污染变色的情况，这是由于复杂基质的吸附导致的。
正常的色谱柱的填料如中间的图所示，表面应平整光滑，色泽洁白，与管壁相齐。
为避免杂质吸附导致峰形变差情况的出现，建议对样品进行充分的前处理，有条件的尽量使用预柱，这样可以有效延长色谱柱的使用寿命。
（3）填料表面发生吸附，或有缓冲盐结晶析出
→使用温和的溶剂，使用小流速，按照高水相、高有机相的顺序对色谱柱进行冲洗后，再次测定柱效来判断色谱柱是否可以正常使用。

如上图所示，这支CR柱在发生了缓冲盐结晶后，柱效变差，所有色谱峰均出现了裂峰现象；使用20%乙腈，按照100μL/min的小流速进行过夜冲洗，再次测定柱效，如有图所示，萘的理论塔板数恢复至12154（出厂时为13727），可见该冲洗操作对色谱柱的柱效有良好的恢复作用。
但，盐结晶之后还能通过冲洗挽回柱效的情况并不多见，所以还是要尽量避免盐结晶的情况发生。

【高盐体系使用注意事项】
（1）色谱柱保存液
→新色谱柱保存液为多为纯乙腈（可根据出厂报告单确认），为避免盐析，请先使用和流动相中有机相与水相比例一致且不含盐的溶液进行冲洗置换（切忌用纯水冲洗柱子）
（2）流动相的置换
→充分考虑不同种类盐的溶解情况
（3）梯度条件
→充分考虑盐在梯度条件中有机相最高点是否能被充分溶解
（4）色谱柱的保存
→由于昼夜温差的影响，建议夜间持续小流速通液以防止盐析；实验完毕后，请使用不含盐的流动相对色谱柱和仪器进行冲洗置换

二、梯度洗脱时，部分峰形变差
可能是由样品溶剂和流动相的溶解性不同引起的，具体请见下图：

【色谱条件】

色谱柱：CAPCELL PAK C18 MG, 2.0 mm i.d. X 150 mm

流动相：H2O, CH3OH，梯度初始有机相为0%

流 速：200 mL/min

柱 温：40 ℃

样 品：杀虫剂的标准混合物质(10 µg/mL)，以甲醇溶解

进样量：10µL

在梯度条件下对多组分样品进行洗脱时，前面的几个峰前延，而后面几个峰拖尾，这是为什么呢？

【梯度洗脱导致峰形变差的原因】

在梯度分析时，如果多组分样品用高溶解能力的溶剂（如甲醇）溶解并且大量进样时……

在刚开始进行梯度洗脱时（此时为高水相），保留弱的样品由于受到溶剂的影响，色谱峰会发生前延；而保留强的样品一旦在高水相下析出，需要花费时间重新溶解到流动相中，因此色谱峰会出现拖尾。

【解决办法】

→降低进样量

→提高梯度条件初始有机相比例
三、在离子对方法中出现裂峰
（1）平衡不充分→确定充分平衡
（2）溶剂效应→用含离子对试剂的流动相溶解样品
（3）过载→降低进样量
（4）离子对试剂添加量不足→使用量控制在 5～10 mmol/L
（5）含有两种或两种以上离子对试剂→建议使用一种离子对试剂，因为多种离子对试剂可能会导致重现性差的问题

下面，介绍一个离子对方法中样品溶剂对色谱峰形影响的分析例：



【色谱条件】
色谱柱：CAPCELL PAK C18 MGⅡ S5; 4.6 mm i.d. x 150 mm
流动相：CH₃CN/H₂O=10/90,pH=2.30 (adjusted with H₃PO₄),
5mmol/L Sodium 1-Hexane Sulfonic Acid
流 速：1.0 mL/min
柱 温：40 ˚C
检 测：UV 210 nm,STD/1
样 品：1. 烟酸2. 烟酰胺 3. 吡哆醇4. 硫胺 5. 核黄素（各200mg/mL）

首先，使用10%乙腈对样品进行溶解，如下图所示，随着样品进样量的增加，吡哆醇和硫胺的色谱峰出现了裂峰愈加严重的现象。

其次，以流动相（含5mmol/L离子对试剂）对样品进行溶解，再次进样，裂峰现象就消失了。

综上所述，建议在进行离子对方法的分析时用流动相溶解样品，并考察进样量对色谱峰形的影响。