摘要：目的 建立一种快速测定人凝血因子Ⅷ冷冻干燥过程中水分含量的方法。 方法 首先采用卡尔费休容量滴定法测定不同冻干程度的人凝血因子Ⅷ的水分含量，做为一级数据，并同时采集样品的近红外光谱；采用K-S方法对样品集进行划分，学生化残差-杠杆值去除异常样品，考察不同的光谱预处理方法，利用iPLS和GA对建模波段进行选择，以R2、RMSEC、RMSECV、RMSEP值为模型评价指标。 结果 所建立模型的主要参数为R2=0.918，RMSEC=0.2141，RMSECV =0.4102，RMSEP=0.3848，线性较好，光谱与样品的水分含量有较好的相关性。结论 建立的FⅧ成品的水分含量模型满足生产需求，是一种快速无损的检测方法，同时减少了FⅧ样品和卡尔费休试剂等的损耗，是一种十分经济有效的方法。
关键词：近红外光谱分析技术 人凝血因子Ⅷ 水分 冻干
血液制品在医疗急救和某些特定遗传疾病治疗上具有其他药品无法替代的作用，但我国当前整个血液制品行业长期处于供不应求的状态，因此提高血浆综合利用率、增加各产品的收率是解决现状的一个必要举措。其中人凝血因子Ⅷ（coagulation factor Ⅷ， FⅧ）是治疗甲型血友病和获得性凝血因子Ⅷ缺乏而致的出血症状等不可或缺的药品，而目前国内生产工艺相对落后，少数企业有能力生产FⅧ。水分是确保产品质量的一个重要参数，它的含量和存在形式对FⅧ的结构和功能影响很大，直接关系到FⅧ产品的稳定性。在生产中，通过冷冻干燥使FⅧ制剂的水分含量在3.0%以下。但是冻干过程无法取样，只能依据经验，通过观察冻干曲线对冻干条件和冻干时间进行控制，无法直接对产品水分含量进行判定；而产品的水分含量测定采用常规的卡氏水分测定方法，具有破坏性切费时费力，而且测定结果无法代表整批产品的特性。近红外光谱分析技术（Near InfraredSpectroscopy，NIRS）是当前最重要的一种PAT技术，它是指应用波长范围在780-2526nm波长范围内的电磁波的一种光谱学方法，在制药、医学诊断、食品和农产品的质量控制，天文学以及治疗医学等领域都有应用。本实验室采用近红外光谱分析技术，对产品进行快速、无损隔瓶测定，并可以实现多点测控，测定冻干产品中的水分含量，以判断干燥终点。
1 材料
1.1 试剂
人凝血因子Ⅷ（冻干剂，200IU/瓶，山东泰邦生物制品有限公司）；甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；卡尔·费休试剂（KFR-06型，天津市科密欧化学试剂有限公司）；注射用水。
1.2 仪器
Antaris Ⅱ傅里叶变换近红外光谱仪（美国Thermo Fisher scientific公司），附件配置：积分球漫反射检测器；KF-4型自动水分测定仪（南京科环分析仪器有限公司）；Alpha 1-2 LD实验室型冻干机（德国Christ公司）；VD-53真空干燥箱（德国Binder公司）；EL204电子天平（METTLER TOLEDO公司）。
2 方法
2.1 样品的制备
取若干瓶FⅧ冻干剂，每瓶加10mL注射用水溶解完全，置于-80℃超低温冰箱预冻2h以上。开启冻干机，使冷阱降温至-55℃，并将真空泵预热。取出预冻完全的FⅧ，放置在干燥室内的搁板上，抽真空开始升华干燥，干燥过程中搁板温度约为-20℃，真空度为10Pa。升华干燥的时间为12-48h不等，到时间后关闭真空泵，通过真空密封阀门使干燥室通气，取出样品。选取部分升华干燥时间在24h以上的样品，转移至真空干燥箱内，进行解析干燥，其余样品封盖密封保存。解析干燥的温度为32℃，真空度为10Pa，干燥时间为5-24h不等。干燥结束后取出样品，压盖密封保存。最终共得到88个样品，通过控制干燥时间的不同使获得的样品拥有不同的水分含量，而且能够涵盖使用该模型预测样品水分时可能遇到的浓度范围，以保证未知样品水分含量的预测是通过模型内插进行分析的，从而使模型具有有效性和实用性。
2.2 光谱的采集
本实验使用Antaris Ⅱ傅里叶变换近红外光谱仪，包括带InGaAs检测器的积分球漫反射分析模块，采用仪器自带的RESULT-Intergration软件编写采集光谱的工作流程。仪器的主要工作参数为：光谱扫描范围为10000cm-1-4000cm-1，分辨率为8cm-1，光谱扫描次数为32，每个样品在不同部位采集3张光谱。近红外漫反射光谱吸收强度设定为lg（1/R）。启动仪器，预热至少30分钟，检查仪器各项性能是否正常。采用仪器自带的RESULT-Operation采集光谱，调用编写好的工作流程，将装有样品的西林瓶直接放在通光孔并固定位置，即可采集样品的傅里叶变换近红外光谱数据。
2.3 水分含量的测定
依据《中国药典》三部附录VII D 水分测定法第一法—卡尔费休容量滴定法，测定样品的水分含量。
2.4 建立校正模型
在MATLAB中运行PLS_Toolbox工具箱进行数据处理，采用PLS建立FⅧ冻干过程中水分含量的定量分析模型。
用K-S分类的方法将样品划分为校正集和验证集。根据学生化残差和杠杆值等统计指标识别并去除异常样品。对光谱数据进行必要的平滑、求导等预处理，以消除噪声和基线漂移等的影响。使用iPLS和GA等方法选择光谱区间，优选与水分含量相关性强的谱区，减少无效信息的使用。
3 结果
3.1 样品制备及水分含量测定结果
共制备得到88个样品，水分含量范围为1.00%-5.30%。其中1-60号样品只进行了不同时间的升华干燥，水分含量在2.04%-5.30%之间；61-88号样品在升华干燥后进行了不同时间的解析干燥，水分含量在1.00%-2.75%之间。
3.2 样品的近红外光谱
所有88个样品的原始近红外漫反射光谱如图1所示。从图中可发现，样品光谱的基线漂移十分严重，所以必须进行适当的预处理，以消除基线漂移以及光谱噪声等的影响。水分子的O-H在近红外谱区有两个特征谱带：5150cm-1的组合频吸收和6950cm-1的OH伸缩振动一级倍频吸收。这两个特征吸收是建模时选择光谱区间的重要依据。
图1 样品的原始近红外光谱图
3.3 校正集样品和验证集样品的选择
采用K-S分类的方法将样品按照2:1的比例划分为校正集和验证集，即58个校正集样品，30个验证集样品。通过主成分分析验证样品划分的合理性，图2为所有样品的PCA得分图，灰色的点为校正集样品的PCA得分，红色的点为验证集样品的PCA得分。可以看出，验证集样品较为均匀地包含在校正集样品范围内，符合校正集和验证集样品划分的要求。蓝色的虚线为95%的置信限，有两个样品位于界限之外，有较大的概率为异常样品，需要进一步排查。
图2 样品的主成分得分图
3.4 异常样品的识别
在校正过程中可能会检测出两类异常样品。一类是高杠杆值样品，与校正集中其他样品相比，光谱不具有代表性，远离模型整体样品的平均光谱，对用于建模的一个或多个光谱变量有显著性贡献，对模型的稳健性有强烈的扰动。另一类是预测值与参考值有显著性差异的样品，由参考值测定误差较大或光谱测量误差较大等原因造成，对回归分析影响较大，可采用学生化残差等方法诊断。所以学生化残差-杠杆值分布图可以较为全面地识别异常样品，进而加以剔除。图3显示了校正集样品的学生化残差-杠杆图，横坐标为杠杆值，纵坐标为学生化残差值。蓝色竖线是杠杆值为3 LV/m的界限，LV为变量数，m为校正样品数量，可以发现有2个样品的杠杆值明显大于3LV/m，应从校正集中剔除；学生化残差应为等方差均匀分布，蓝色横线为3倍方差均值的界限，有1个样品的学生化残差几乎处于界限之外，也可认为是异常样品。将去除异常点的样品作主成分分析，PCA得分图如图4所示，可以看到，所有的样品都位于95%的置信限内。
图3 学生化残差-杠杆图
图4 去除异常样品后的主成分得分图
3.5 光谱数据的预处理
从样品的原始近红外光谱中已经看到，光谱的基线漂移十分严重，同时光谱测量过程中引入的噪声也会对模型产生不利影响，所以在模型建立之前要采用各种方法对光谱数据进行预处理，包括微分、平滑、SNV、OSC等，并将这些方法进行适当的组合，通过比对预处理后的建模结果，优选出最佳的预处理方法。表12则列出了这些模型的评价参数，通过对比，可以直观地选出最佳的预处理方法，即二阶导数、SG 13点平滑与OSC结合的方法。
表1 不同预处理后各模型参数
| 评价参数 预处理方法 | R2 | RMSEC | RMSECV | RMSEP |
| 无 | 0.789 | 0.4646 | 0.5301 | 0.4835 |
| Autoscale | 0.798 | 0.4542 | 0.5393 | 0.4669 |
| SNV | 0.789 | 0.4497 | 0.5230 | 0.5126 |
| OSC | 0.800 | 0.4350 | 0.5341 | 0.5006 |
| 1st+SG | 0.791 | 0.4698 | 0.5100 | 0.4693 |
| 2nd+SG | 0.873 | 0.2853 | 0.4894 | 0.4941 |
| 2nd+SG+Autoscale | 0.894 | 0.2156 | 0.6199 | 0.4798 |
| 2nd+SG+SNV | 0.841 | 0.3168 | 0.4946 | 0.5571 |
| 2nd+SG+OSC | 0.914 | 0.1670 | 0.5303 | 0.4506 |
1st+SG：一阶导数+SG平滑
2nd+SG：二阶导数+SG平滑
3.6 光谱区间的选择
通过光谱区间的筛选，可以选择与样品水分含量相关性大的光谱变量进行建模，去除大量的无关变量，减少建立模型的计算量，并使模型的效果更好。但是选择的光谱区间过窄，则有可能丢失有效信息而降低模型分析的准确度，所以谱区的选择需要进行反复的优化。本实验考察了iPLS和GA两种光谱区间选择的方法，根据模型结果的优劣确定最终使用的光谱区间。表2显示了使用不同的方法进行谱区选择后建模的结果。通过对比可以发现，GA选择光谱区间后的模型结果得到了较好的改善，尤其是RMSEP得到了较为明显的降低，而且所选用的光谱区间包含了水分的特征吸收区域，所以最终采用GA作为最终谱区选择的方法。
表2 不同谱区选择方法的建模结果
| 模型参数 谱区选择方法 | R2 | RMSEC | RMSECV | RMSEP |
| 无 | 0.914 | 0.1670 | 0.5303 | 0.4506 |
| Forward iPLS | 0.920 | 0.1160 | 0.3517 | 0.4722 |
| Reverse iPLS | 0.886 | 0.3043 | 0.4550 | 0.4500 |
| GA | 0.918 | 0.2141 | 0.4102 | 0.3848 |
最终确定了OSC结合二阶导数加SG平滑的预处理方法，以及GA作为谱区选择方法。所建立模型的主要参数为R2=0.918，RMSEC=0.2141，RMSECV =0.4102，RMSEP=0.3848
4 讨论
所建立模型在工厂接受范围内。通过验证，模型的线性、分辨能力、准确度和精密度等均符合要求，证明了该模型的实用性与有效性。
该模型的建立，是实现在线监测冻干过程中FⅧ制剂水分含量变化的坚实基础，一旦在线监测系统得以实现，冻干过程将由通过电阻、压强等间接参数的控制转变为样品水分含量的直接监控，使冻干时间得到极大的优化，避免因冻干时间过长造成的FⅧ活性损失，而利用光纤进行多点监控，可以保证整批产品的水分含量都达到标准，使不合格产品的数量达到最低。同时此模型也可应用于FⅧ成品的水分含量测定，作为一种快速无损的检测方法，减少了FⅧ样品和卡尔费休试剂等的损耗，是一种十分经济有效的方法。
参考文献
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