【资料】PCR扩增过程中常见的问题及解决方法

⒊ 试剂的敏感度：
有时试剂检测的阳性率偏低，所谓阳性率偏率就是指出现假阴性结果，这种现象往往与以下三种因素有关：①试剂质量不过关；②操作方法不规范；③主观判断标准不科学。对于试剂质量及操作是否正确这两点是比较容易检查并合理改进。这里着重提一下：目前经常碰到的一些不科学概念，我们习惯用某些样本应该阴性，某些样本应该阳性，或简单地以阳性率。主观概念判断试剂是否合格这是极不科学的主观推论。如对乙肝血清的测定，就不能用抽象的阳性率应该是60％或20％这样的概念来判断，同样也不能用“二对半”的结果评判“PCR结果”，这是因为“二对半”与“PCR”是两种完全不同的检测方法，其检测结果的意义有质的区别，它为医务人员提供的信息是大不相同的，更加之所使用的“二对半”试剂是否能作为质量评价标准仍待考定。目前世界上较公认的标准品只有雅培的“两对半”试剂，国内的“二对半”试剂据卫生部抽查资料表明，一度合格率在50％以下，怎么可能作为质量评定标准呢！对试剂敏感度的评价标准应该使用下述方法科学地评价，首先选择标准样本如HBV全序列质粒，标准阳性血清，结核菌菌体等用合适的介质如血清、痰液等进行有限稀释按1：10、1：100、1：1000、1：10000如此逐步提高稀释度价其试剂的敏感度，一般认为如果标准阳性乙肝的血清用正常血清稀释10000倍以上，结核菌每毫升中在100个左右仍能测出阳性结果时，试剂的敏感度是足够的，判断试剂的灵敏度是足够的，判断试剂的灵敏度后仍需判断试剂的检测覆盖，因为病原微生物有不同的型或变异株，合格的试剂不应漏检。最后还要判断试剂盒的异性，一般的实验室可以用不同病原体的样本按说明书操作来判断其对其它病原体扩增时是否也有阳性出现，其特异可达到怎样的精度，经过以上三个方面的研究便可以科学地判断试剂的质量。
三、 扩增产物拖尾
有时扩增产物电泳后出现一个个萤光团（Smear现象）或出现一连串的条带，这些种现象主要与以下几种因素有关：
⒈ 扩增系统不完善：
这种现象表明出现非特异性扩增，而产生非特异性扩增与扩增系统中镁离子浓度、引物浓度、DNTP浓度有密切关系，需认真调整以期避免这种现象出现。另外也可以适当提高退火温度，从而提高扩增特异性。
⒉ 模板处理方法不完善：
PCR扩增技术的原理虽然非常简单，但这一技术的合理应用是极其复杂的，如对PCR主要成分之一DNA聚合酶的影响因素很多，这些因子是怎样作用于聚合酶，其作用机制至今仍不清楚，因此对样本处理不当不妥可能抑制扩增，也可能导致非特异扩增。一般分泌物样本，应取脱落细胞为主，避免采集过多的脓性分泌物，痰液样本一定要充分液化，等等。
⒊ 引物设计不合理：
引物设计应遵循以下几个原则。首先，引物一般应由15-30个BP组成；其次，引物中碱基应是随机分布，不能有一串相同碱基或出现其它不常见结构；第三，GC碱基含量应在45-55％左右；第四，两个引物在3′未端不能出现同源性。其中以引物与基因组之间的同源性是产生非特异性扩增的最主要原因，而我们一般在设计引物时往往只了解其基因组中的某一段序列，因此我们必须充分利用这些资料巧妙地设计出一组合理的引物，并通过反复比较、证实，最后才能确定其能否用于检测。
四、 产物电泳单萤光带及多萤光带一般PCR扩增后，对扩增结果的判断最简单的方法是，琼脂糖电泳，溴乙淀染色，在320nm的紫外激发观察其萤光条带，如果有明显和特异性扩增产物，就会在电泳平板预期的位置出现一条清晰的萤光亮带，按标准扩增系统配制的反应液，其引物浓度在0.1-0.5mM，一般经30个循环扩增后，仍有相当数量的游离引物存在，因此在电泳平板就有一条20BP左右（电泳速度较快）的淡淡的引物萤光带，这样每次电泳结果就有两条荥光带，一条在前面的，每个点样样本都有的引物带。
引物设计相当重要，由于基因组有庞大数量的DNA序列，除了特异性的扩增外，往往很容易产生非特异性产物。如果引物与基因组存在较广泛的同源性，那么就会出现严重的非特异性扩弗，引物不仅与特异性的扩增区域结合，而且也与其它区域发生一系列非特异性结合，而选择引物时，常须考虑敏感性问题，特别是临床检验试剂盒，为了能把少至几个病原体检出，我们大都采用在病原体基因组中重复出现的DNA序列设计引物，如果这些重复序列没有严格的同源性，就在可能出现不同长度的扩增产物而出现多条带扩增。
病原体变异，与前面所述一样，我们为得高敏感性经常使用具有重复序列的基因作为引物设计的区段，在有些病原体，比如结核杆菌在治病过程中，会发生严重畸变，也包括其遗传物质的变化，出现染色体的缺失、不等位交换、其它序列的插入等。如果这些缺失与不等位交换正好发生在我们所选择的扩增序列上，也会出现不同长度的扩增产物，从而产生多条扩增产物带。
PCR基因扩增技术简单易行，应用日趋广泛，但其影响因素很多，在实践过程中时常现现这样或那样的问题，甚至得不到预期的结果，或出现无法解释的现象。诚然，近年来在大量科学工作者的共同努力下，取得了许多宝贵的经验，使这一技术日趋完善，毕竟PCR是一项近几年才出现的新技术，许多问题至今仍然不能得到很好地解释或解决。想信随着对PCR的深入研究，在PCR的应用过程中不断总结经验，PCR这一新技术将会为人类的发展作出更大的贡献。

呵呵，写得还挺全的

写的挺不错的啊