大家看看我的实验方案问题大吗？

GJZTZX

2017/02/21

私聊

液质联用（LCMS）

做蛋白酶解实验，测序分析。如下：
1目的：通过比较2种糖基转移酶的结构特征，为其他糖基转移酶的鉴定提供一定的基础。
2试剂：胰蛋白酶(trypsin)，三氟乙酸和乙腈，双蒸水，碳酸氢胺，，三种酶，乙腈，DTT，IAA，氢氧化钠，盐酸。
仪器：液相色谱质谱，容量瓶10mL 4支，微量移液管，水浴锅，1．5 mL聚丙烯小管.
3方法
3.1取一种酶比较DTT加入前后该酶的质谱。
3.1.0取约0.2mg的a、b酶分别放入1、4号离心管中，Proteins (1 mg)were dissolved 1ml 100mM NH₄HCO₃中, (pH=8.0)溶液中，得到0.2mg/mL的蛋白溶液。向离心管中加入1 μg·μL-1胰蛋白酶（1；25）溶液25 μL，37℃酶解16 h。
3.1.1取约0.2 mg的a、 b酶分别放入2、5号离心管中，Proteins (1 mg) were dissolvedand denatured by 100 uL urea 溶于NH₄HCO₃中(8 M), incubated for 3 h.再加入900ul100mM NH₄HCO₃中,(pH=8.0)溶液中，得到0.2mg/mL的蛋白溶液。向离心管中加入1 μg·μL-1胰蛋白酶（1:25），37℃酶解16h。
3.1.2取约1 mg的a、b酶放入3、6号离心管中，Proteins (0.2mg) were dissolvedand denatured by 100 uL urea (8 M), incubatedfor 1 h.and further20 uL DTT (50 mM) was added for thereductionof disulfide linkages at 60 ◦C for 1 h. After cooled down to room temperature,40 uL IAA (50 mM) was added foralkylation in the dark for 30 min, followed by dilution with 100 mM ammonium bicarbonatebuffer (pH, 8.2)。向离心管中加入1 μg·μL-1胰蛋白酶溶液(100mM NH₄HCO₃，pH=8.0)（1:40？），37℃酶解12 h。取其中50 uL进样分离，测定肽图谱。比较1、2,3号离心管样品肽段的数目。鉴定的覆盖率。
3.2相同处理对酶的质谱结构比较研究。
进样，测得离心管中样品酶质谱,比较同一条件下的质谱。网上进行Mascot 检索。利用PMF和MS/MSIons Search检索。比较酶的质谱检索结果。
得到2种酶的pmf图后，选取8个离子丰度靠前的离子进行cid处理，得到二级质谱图，进行MS/MS Ions Search检索。通过检索，找出肽段的匹配离子，比较S/N和肽段数目。序列覆盖度说明酶切效果。包括酶的肽段数目，序列相似性。
同时对2种酶序列进行比较分析。
3.3 碎裂电压对酶的质谱影响。
1号离心管样品进样。碎裂电压从30eV到120eV，观察1号离心管a酶的质谱信息。比较不同破碎电压下酶的肽段数目。
肽段1和2：设置梯度为：10 30 50 70 90
整个实验重复两次。
4结果

主要从质谱图对2种酶进行讨论。分三个方面，对应方法中的三个分析。主要列下Tic图，1级质谱图，并举例说明某个离子的二级质谱图。