“超高效液相色谱-串联质谱法测定大豆中草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸的残留”是本人去年开展大豆中草甘膦检测项目整个试验过程的总结，欢迎各位老师和同行批评指正，该文章还未在任何刊物上发表。
超高效液相色谱-串联质谱法测定大豆中草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸的残留
户江涛
（黑龙江省农垦科学院测试化验中心，黑龙江 佳木斯 154007 ）
摘要：采用超高效液相色谱-串联质谱法建立了快速检测大豆中草甘膦和氨甲基膦酸残留量的分析方法。试样经水超声提取，二氯甲烷去除脂肪，C18固相萃取柱净化后，在硼酸钠缓冲溶液中与9-芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）进行衍生反应，其衍生产物在C18色谱柱上以 2 mmol/L 乙酸铵溶液和乙腈为流动相，进行液相色谱分离：质谱检测采用电喷雾正离子化模式和多反应监测模式（MRM）。结果表明，草甘膦和氨甲基膦酸在0.001~0.5 mg/L范围内线性关系良好，相关系数（R）分别为0.9996和0.9993，定量限（LOQ）均为0.01mg/kg。在空白大豆样品添加浓度为0.02、0.2、2 mg/kg 时，草甘膦和氨甲基膦酸的平均回收率分别为80.2%~91.5%和77.7%~89.3%，相对标准偏差（RSD）分别为3.37%~6.96%和4.11%~8.27%（n=6）。本方法快速、简便、灵敏，适用于大豆中草甘膦和氨甲基膦酸残留的同时检测。
关键词：超高效液相色谱-串联质谱；大豆；草甘膦；氨甲基膦酸；衍生反应
Determination of glyphosate and its metabolite aminomethyl-phosphonic acid residues in soybean by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
HU Jiangtao
(Testing and Analysis Center of Heilongjiang Academy of Land Reclamation Sciences, Jiamusi 154007,China)
Abstract：A method was developed for the determination of glyphosate(PMG) and aminomethyl-
phosphonic acid(APMA) residues in soybean by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS). After extracted with water under ultrasonication, the sample was defatted with dichloromethane and purified by C18 solid phase extraction cartridge, and then PMG and APMA were derivatized using 9-fluorenylmethoxycarbonyl(FMOC-Cl) in borate buffer for 2 h.The derivatives of PMG and APMA were separated on a Waters BEH C18 column with gradient elution with the mobile phase of 2 mmol/L ammonium acetate and acetonitrile, and finally detected by positive eletrospray ionization-mass spectrometry(ESI+-MS/MS) in multiple reaction monitoring(MRM) mode.The results showed the linearities of PMG and APMA were good in the concentration range of 0.001~0.5 mg/L ,and the correlation coefficients were 0.9996 and 0.9993 respectively. The limit of quantification(LOQ) of PMG and APMA was both 0.01
mg/kg. At the spiked levels of 0.02、0.2、2 mg/kg in the blank soybean samples, the mean recoveries of PMG and APMA were 80.2%~91.5% and 77.7%~89.3% respectively, and the relative standard deviation(RSD) of PMG and APMA were 3.37%~6.96% and 4.11%~8.27% res-
pectively（n=6）.This method is fast,simple,sensitive, and suitable for simultaneous determination of PMG and APMA in soybean.
Key words: ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-
MS/MS); soybean;glyphosate(PMG) ;aminomethyl-phosphonic acid(APMA); derivatization
草甘膦（Glyphosate，PMG）又名镇草宁、农达，分子式为C3H8NO5P，是1971年美国孟山都公司研发的一种有机磷除草剂，因其兼具内吸、传导性、灭生性及非选择性，同时不易在生物体内累积，故广泛应用于农业生产中一年生和多年生杂草防除，是目前世界上应用最广、生产量最大的除草剂。草甘膦及其在植物中的主要代谢物氨甲基膦酸（Aminomethyl-phosphonic acid，APMA，分子式为CH6NO3P）均属于强极性、易溶于水的高沸点化合物，具有不易挥发、无紫外吸收等特性，因此用常规方法分析检测十分困难。
目前， PMG和APMA残留检测的方法主要有色谱法（GC、LC、IC）、质谱法（GC/MS、ICP/MS、LC/MS/MS）、光谱法 等。光谱法虽然操作简便，但其灵敏度不高，而离子色谱法只能适用于水样等简单基质，用于植物源样品检测时干扰太大；用气相色谱和气质联用技术检测时，需要将PMG和APMA衍生转化为可气化物质，其引入试剂多、过程相对繁琐，效率较低；用LC/MS/MS法直接检测时，由于PMG和APMA分子量（分别为169、111）均较小，其主要碎片离子的质荷比多在100以下，检测实际样品时受基质干扰严重，灵敏度较低，因此柱前衍生——液质联用法成为近年来国内外检测PMG和APMA残留的主流方法。以9-芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）做为衍生试剂，在硼酸盐缓冲溶液中与PMG和APMA水提取液相容性好，过程简单，其衍生产物在LC/MS/MS中响应信号高，碎片离子干扰小，适合定性定量分析。
目前，采用柱前衍生——LC/MS/MS法检测茶叶、稻米等基质中PMG和APMA残留的报道很多，专门针对大豆基质的报道很少。行业标准的适用范围虽然包括了大豆基质，但该方法在实验过程中试剂用量大、操作繁琐（反复调pH值）、衍生时间长（需过夜），尤其是使用阳离子交换柱（CAX）洗脱时需要加入11 mL 1%的盐酸甲醇水（20/80，v/v），水分含量过高导致旋转蒸发时很难蒸干，容易造成PMG和APMA回收率不稳定。本文专门针对大豆这类高蛋白、高脂肪含量的特殊基质，采用纯水作为提取试剂，二氯甲烷去除脂溶性杂质，C18固相萃取小柱净化后采用FMOC-Cl衍生，最后用UPLC/MS/MS测定。该方法前处理过程简便、快速、灵敏度高，适用于大豆中PMG和APMA的残留检测。
1 实验部分
1.1 材料与试剂
草甘膦、氨甲基膦酸（纯度≥99%，德国Dr.Ehrensorfer公司）；FMOC-Cl（纯度>99%，Sigma公司），使用时配置成10g/L的丙酮溶液；乙腈、二氯甲烷、甲酸、乙酸铵（色谱纯，美国Fisher公司）；十水四硼酸钠（优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），使用时配置成50g/L的水溶液；实验用水为Millipore纯水仪制备；C18固相萃取小柱（200mg/3ml，美国Agilent公司）。
1.2 仪器与设备
Acquity UPLC型超高效液相色谱仪（Waters公司）；XEVO TQ-S三重四级杆质谱仪（Waters公司）；CR21GⅢ型高速离心机（HITACHI公司）；KQ5200DB型台式超声波仪（昆山市超声仪器有限公司）；涡旋混合器（IKA公司）。
1.3 标准溶液的配置
分别称取草甘膦和氨甲基膦酸标准品10mg（精确到0.1mg），用水溶解并定容至10mL，配置成质量浓度为1.0 mg/mL标准储备液，于4℃冰箱保存待用；使用时用水逐级稀释成所需浓度的混合标准工作液。
1.4 样品前处理
提取：称取粉碎均匀后的试样1.0g（精确到0.01g）于50mL聚乙烯离心管中，加入10.0mL超纯水，涡旋混合30 s并超声提取20 min后，以10000 r/min离心3 min，将上清液转移至另一离心管中，加入5 mL二氯甲烷涡旋混合30 s，以10000 r/min离心3 min，上清液待净化。
净化：取2.5 mL上清液加入到C18固相萃取柱（使用前依次用3mL甲醇和3mL超纯水活化）中，弃去最初的几滴流出液（约0.5 mL），将剩余部分用5 mL玻璃管收集，待衍生。
衍生：取1.0 mL净化液于5 mL离心管中，依次加入1.0 mL 50g/L的硼酸钠溶液和 1.0 mL 10g/L的FMOC-Cl衍生液，混匀后室温下衍生2 h，以10000 r/min离心3 min，取上清液过0.22 mm有机系微孔滤膜后，供UPLC/MS/MS分析测定。
1.5 液相色谱及质谱条件
液相色谱：色谱柱:Waters BEH C18（1.7 μm，50mm×2.1mm）；柱温：30℃；流速：0.5 mL/min；进样量：2 μL；流动相A：乙腈；流动相B： 2 mmol /L 的乙酸铵水溶液。梯度洗脱程序：0~0.5min，10% A；0.5~3. 0 min，10%~100% A；3. 0 ~4. 0 min，100%A，4 ~4.1min，100% A~10% A，4.1 ~5.0min 10% A。
质谱：离子源：电喷雾离子源( ESI + ) ；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测( MRM)；毛细管电压：3.2 kv；离子源温度：150℃；去溶剂气温度：500℃；去溶剂气流量：1000 L /h；定性、定量离子对及碰撞能量见表1。
表1 PMG-FMOC和 AMPA-FMOC的MRM质谱参数
Table 1 MRM parameters of PMG-FMOC and AMPA-FMOC
Analyte | Cone/V | Parent ion/(m/z) | Daughter ion/(m/z) | Collision energy/V |
PMG-FMOC AMPA-FMOC | 30 30 | 392 334 | 88 214﹡ 112﹡ 179 | 14 8 11 20 |
﹡quantitative ion
2 结果与讨论
2.1 色谱及质谱条件的优化
流动相的选择：对比了酸性体系（0.1%甲酸水溶液）与非酸性体系（乙酸铵水溶液）分别于甲醇、乙腈的流动相体系组合，结果发现两种分析物在酸性体系中分离效果欠佳，峰形拖尾严重，而在非酸性体系中其色谱分离效果得到明显改善，峰形对称；乙腈比甲醇体系洗脱能力更强，可以有效缩短分析时间。故本研究采用乙酸铵水溶液+乙腈流动相体系，并比较了1、2、5 mmol/L三种乙酸铵浓度与乙腈的组合，结果发现随着乙酸铵浓度的增加，目标物响应值虽略有提高但相差不大，而同时仪器背景值却显著升高，综合考虑目标物信号强度、信噪比、色谱分离效果以及分析时间等因素，本实验最终选择了2 mmol /L 乙酸铵水溶液+乙腈分析体系。
质谱的选择：PMG、 AMPA对应的衍生物PMG-FMOC、AMPA-FMOC分子量分别为391、333。用超纯水配置10 mg/L 混合标准溶液直接注射到质谱中，在正负离子模式下分别进行母离子全扫描，发现正离子模式下392、334具有很好的响应，然后分别以392、334为母离子进行子离子全扫描，各得到两组丰度高、干扰小的子离子对进行MRM监测，最终确定的质谱条件见表1。
2.2 前处理条件的优化
提取溶液的选择：PMG和APMA属于强极性物质，易溶于水，难溶于有机溶剂，故一般采用极性溶剂提取，如纯水及KOH、NaHCO3溶液等。实验发现，用碱性溶液提取后，大豆中脂肪、蛋白等物质会与碱性物质发生反应，导致离心后的提取液异常浑浊，不利于后期净化和衍生，因此本实验采用纯水作为提取试剂，再经二氯甲烷液液萃取去除脂溶性杂质。
净化柱的选择：研究发现，对提取后的溶液不经SPE净化直接进行衍生， PMG和APMA的回收率均不足30%，且精密度很差，这可能是由于大豆中富含脂肪、蛋白质等物质干扰衍生过程，故本实验比较了对脂肪、蛋白质有很好去除效果的C18、中性Al2O3、HLB固相萃取SPE柱的净化效果，结果发现提取液经中性Al2O3净化后，PMG和APMA几乎检测不到；而C18净化后目标物回收率为92.7%、90.8%，HLB为83.6%、80.5%。故本实验选取了净化效果更好，成本相对低廉的C18固相萃取小柱。
衍生条件的优化：FMOC-Cl的衍生机制是在碱性环境下（pH=9.0）通过FMOC-Cl基团取代目标化合物氮原子上的氢，从而生成较稳定的化合物FMOC-Cl。参照行业标准及文献报道所选用的缓冲液浓度，本实验采用50g/L的硼酸钠水溶液缓冲液体系，设置的衍生试剂质量浓度为1、2、5、10、20 g/L FMOC-Cl丙酮溶液，按照本文1.4步骤对PMG和APMA质量浓度为0.5 mg/L的纯水溶液和大豆空白基质溶液分别进行衍生，结果见图1。结果表明，在纯水溶液中，FMOC-Cl浓度为2 g/L时，PMG和APMA的峰面积已达到最大，随着衍生化试剂浓度的升高，其峰面积无明显变化；而在大豆空白基质溶液中，FMOC-Cl低浓度（1、2g/L）时，PMG和APMA几乎检测不到，其峰面积随衍生化试剂浓度增加而加大，浓度到达一定程度（10 g/L）时，峰面积不再变化。产生这种现象的原因，可能是由于尽管大豆提取液经过了二氯甲烷和C18小柱的净化，但还是会有少量水溶性蛋白、脂肪等杂质残留在净化液中，这些杂质可能会与衍生试剂反应，影响目标物的衍生效果。研究还发现，当FMOC-Cl浓度为20 g/L时，得到的PMG和APMA色谱峰产生拖尾现象，可能是由于衍生试剂化学性质较活泼，其用量大时，过量的FMOC-Cl会迅速转化成FMOC-OH，干扰目标物峰形。在50g/L硼酸钠水溶液、10 g/L FMOC-Cl丙酮溶液条件下，考察不同时间（0.5h、1h、2h、4h、8h和16h）对衍生效果的影响，结果发现，2 h后PMG和APMA的测定值无明显增加。因此，本实验最终选定的衍生条件为50g/L硼酸钠水溶液、10 g/L FMOC-Cl丙酮溶液，室温下衍生2 h。
2.3 基质效应的考察
基质效应（主要是抑制）是LC/MS/MS仪器检测时经常遇到的现象。由于本实验采用极性很强的水作为提取剂，大豆中的色素、脂肪酸等极性较强的物质也有少部分进入到最后的上机液中，在离子化带电过程中会与目标物产生竞争，抑制目标物的离子化效率。实验考察了用PMG和APMA的纯水标样去标定经过本文1.4步骤处理后的大豆空白基质溶液配置的同浓度标样，其色谱图见图2。结果发现，PMG在纯水和大豆空白基质中峰面积基本一致，而APMA在大豆空白基质中的峰面积仅为纯水中的55.7%，产生了明显的基质抑制效应。为了消除基质干扰，本实验选用大豆样品空白基质配置不同浓度的标准溶液来绘制标准曲线进行校准。
2.4 线性范围和定量限
用大豆空白基质溶液分别配置0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L的PMG和APMA混合标准溶液，按本文1.4步骤衍生后测定，以各自定量离子的峰面积为Y对应质量浓度X（mg/L）做标准曲线，得到的线性方程和相关系数见表2。结果表明，这两种物质在0.001~0.5 mg/L浓度范围内线性良好，相关系数R分别为0.9996和0.9993。以10倍信噪比（S/N）计算，该方法PMG和APMA的定量限（LOQ）均为0.01 mg/kg。
表2 PMG和APMA大豆基质标准溶液的线性方程、相关系数和定量限（LOQ）
Table 2 Linear equations,correlation and LOQ of PMG and APMA in the soybean matrix standard solutions
Analyte | Linear range/(mg/L) | Linear equation | R | LOQ/(mg/ kg ) |
PMG AMPA | 0.001~0.5 0.001~0.5 | Y=889809x+1671.3 Y=476982x+1161.9 | 0.9996 0.9993 | 0.01 0.01 |
2.5 回收率和精密度
称取大豆空白试样1.0 g，分别添加0.02、0.2、2 mg/kg水平的PMG和APMA混合标样，每个水平重复6次，按照本文1.4步骤前处理方法处理后上机检测，实验结果见表3。从表3可以看出，PMG的平均回收率为80.2%~91.5%，相对标准偏差（RSD，n=6）为3.37%~6.96%；APMA的平均回收率和RSD分别为77.7%~89.3%和4.11%~8.27%。
表3 大豆中PMG和APMA的加标回收率和相对标准偏差（n=6）
Table 3 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of PMG and APMA spiked in the soybean（n=6）
Analyte | Spiked level(mg/kg) | Recovery/% | RSD/% |
PMG
AMPA | 0.02 0.2 2 0.02 0.2 2 | 80.2 91.5 86.8 77.7 89.3 85.9 | 6.96 3.37 3.95 8.27 4.25 4.11 |
本文建立了超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC/MS/MS）测定大豆中草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸残留的分析方法。该方法灵敏度高，PMG和APMA定量限（LOQ）达到0.01 mg/kg，能满足大豆产品相关限量标准要求。同时该方法具有较高的准确度和精密度，前处理步骤简单快速，特别适合大批量大豆样品的检测。
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