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动物源成分鉴定之PCR技术

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2017/07/13

食品毒素/微生物检测

随着人们生活水平的不断提高，食品安全变得尤为重要。对于肉制品中动物源性的检测成为现在的一个新的领域。往往会看到刷羊肉中掺杂鸭肉、牛肉干其实用的是貂肉等新闻。目前这项检测技术并没有完全普及实验室，今天和大家一起探讨一下运用PCR技术测定动物源成分（即动物源成分鉴定）。好多肉肉，不知道吃的是什么肉。
一、实验室场地要求
PCR实验室的场地明显区分于化学检测。对于实验室要求符合《GB/T 19495.2-2004 转基因产品检测实验室技术要求》，要具备样品制备区、核酸提取区、扩增区和检测区四大功能区，并且对于各个工作区域的压力有一定的要求。我公司拥有完整的PCR实验室（如图），我们的方法开发也在这里进行的。请叫我摄影师！下面图片都是我拍出来的。
PCR检测室

准备室

提取室

扩增室

检测室

二、实验仪器设备
1.荧光定量PCR测定仪（博日 FQD-96A）
2.普通PCR测定仪（博日 NPA-32）
3.核酸测定仪（Thermo Narodrop）
4.凝胶成像仪（勤翔 1850）
5.粉碎机
6.液氮及研磨装置
7.恒温水浴锅
8.移液器
9.电泳
三、试剂和耗材
1.动物基因组DNA抽提试剂盒
2.无水乙醇
3 .10×PCR反应液
4 .dNTP
5 .Taq酶
6.引物
7 .纯狗肉（阳性对照）、其他非狗肉相近动物源，如貂（阴性对照）
8 .1.5mL离心管、枪头、PCR反应管
四、实验方法
（1）样品DNA的提取
a、将约30mg的新鲜动物组织在液氮中充分研磨成粉末，并转移至1.5mL的离心管中。
b、加入200μL 缓冲液GA，震荡至沉底悬浮，加入20μL Proteinase K，溶液混匀后，56℃放置直至组织溶解，期间混合样品2~3次。
c、加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液变清亮后，简短离心，去除管盖内壁的水珠。
d、加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，简短离心，去除管盖内壁的水珠。
e、将上一步所得溶液加入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
f、向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
g、向吸附柱CB3中加入600μL缓冲液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
h、重复操作步骤g。
i、将吸附柱CB3放回离心管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
j、将吸附柱CB3转入新的1.5mL离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50~200μL的洗脱缓冲液TE，室温放置2~5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存。
（2）定性PCR检测
a、配制反应体系

试剂名称
体积(μL)
10×PCR反应缓冲液
5
dNTP
4
上游引物
1
下游引物
1
Taq酶
0.5
模板
2
水
36.5
总计
50

b、反应程序
变性
扩增
循环次数
最后延伸
94℃ 3min
94℃ 30S
35
72℃ 5min
58℃ 45S
72℃ 45S

c、反应对照设置
阳性对照：用纯狗肉所提的DNA作为模板

阴性对照：用非狗肉，如貂肉等所提DNA作为模板
空白对照：用配制反应体系的实验用水代替模板
（3）凝胶电泳检测PCR产物
a、称取1g琼脂糖，加入50mL TBE缓冲液，微波加热溶解。
b、稍冷却后，加入5μL 4s Red Plus核酸染色，倒入制胶板，放置凝固。

c、取5μL所提DNA和1μL 6×Loading Buffer混匀，加到点样孔中。
d、100V电泳10min，然后将电压调至110V，电泳35min。
e、凝胶成像观察电泳结果。
（4）限制性内切酶酶切及产物电泳检测
如果PCR扩增产物电泳检测结果阳性，进行限制性内切酶酶切反应

a、反应体系

试剂名称
体积(μL)
酶切缓冲液
2
Hph I酶
2
PCR扩增产物 16
总计
20

b、反应条件
37℃ 20min
（5）结果分析与判定
a、酶切后有目的基因条带，且阳性对照、阴性对照和空白对照均正确，可根据结果判定被检样品中含有狗源性成分。

b、酶切后不含有目的基因条带，且阳性对照、阴性对照和空白对照均正确，可根据结果判定被检样品中不含有狗源性成分。
c、如阳性对照、阴性对照、空白对照有一项不符合判定标准，则应重新试验。
终于写完了，请大家多多支持！谢谢

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Kevin

第1楼2017/07/14

支持原创，促进交流

0

zyl3367898

第2楼2017/08/01

应助达人

有没有国家标准，防止挂羊头卖狗肉。前面的图片很丰富，为何前处理没有图片了。

0

zhangrenliang

第3楼2017/12/14

常见动物源性成分测定-膜芯片法，2017年05月获得立项批准，编号：20170498-T-424
"食品中高通量动物源性成分鉴定-膜芯片法”进入国家食药监局系统快速检测方法公示阶段，待正式批准
国家标准化管理委员会官网http://www.sac.gov.cn/

0

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