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【我爱创新】色谱进阶-色谱仪的标定

皮皮鱼

2017/08/29

私聊

气相色谱（GC）

大家好，今天我们来谈谈色谱仪的标定。
我们为什么要标定色谱呢？因为色谱本身是无法自己定量的，必须依赖标准物来标定检测器对标准浓度的响应值，然后根据未知组分的响应值与标准组分的对比，确定未知组分的浓度。
不过可能有些朋友说，面积归一化法定量并不需要标准物啊！哦，不是的，面积归一化法其实也是标定过的，因为面积归一化法默认所有组分的校正因子相同，这个是经过标定才确定的。
如果你读了我的色谱定量方法一节，您就会了解，所有内标法、百分比法（面积归一化法）、带校正因子的面积归一化法，其实都是源自外标法。而外标法，源自检测器的线性响应，以及由塔板理论得到的柱流出口浓度时间积分值与进入色谱柱组分总量的线性响应。有了这两条，才能保证检测器的信号值的时间积分值，也就是峰面积，与组分的进样总量成正比。在进样体积确定的情况下，峰面积就与浓度成正比了。
这里需要注意，我们所说的“浓度”，是指狭义的浓度，即必须是以体积为分母的浓度单位，像质量分数这样的是不行的。关于色谱定量结果的单位，我曾经专门发了一个帖子详细讨论过，这里也不多谈了。
这次我们主要想谈的是色谱仪的标定，既然所有色谱定量方法的基础都是外标法，那么我们先从外标法的标定谈起。
一、外标法的标定
理论上来说，检测器是线性响应的，而且过零点，因此外标法的公式是c=gA。这里c是待测组分浓度，g是绝对校正因子，A是峰面积。从这个公式上看，我们在这个直线上选取任意一点（c，A），都可以得到校正因子g。也就是说，只要有任意一个已知浓度的标样，到色谱仪上分析一次，就能得到准确可靠的绝对校正因子g了。
但实际情况并不如此。我们还要考虑很多因素。这些因素包括以下几点。
1、检测器的线性区间。
检测器的线性并不是无限长的。在定量下限之下，响应曲线是不存在的。因此标准样品的浓度不能低于定量下限。这是对标准物浓度的第一条要求。
同时，当浓度足够高，到达定量上限的时候，响应曲线就真的变成曲线了，会向下弯曲。这里我就不上图了，在检测器一节中有这个图。因此对标准物浓度的第二条要求是标准样品的浓度不能高于定量上限。
2、基线噪声的固定误差。
是否标准样品的浓度在定量下限和定量上限之间就没问题了呢？也不是，因为我们必须考虑误差。
和大多数分析仪器一样，色谱定量的误差也包括两部分，即一个小的固定的绝对误差，和一个用百分数表达的相对误差。色谱定量误差的绝对误差部分，主要来源于基线噪声。下面这个图，是一个放大的色谱基线和峰的图。

从这个图中，两条兰线之间的黑色折线是色谱基线。我们知道，色谱的基线总是有一定宽度的，当色谱峰出来后，在正确的积分条件下，蓝线上面的绿色面积一定会得到准确积分。但基线宽度内的红色部分，就不确定了。因为峰起点和终点每次并不完全确定在基线宽度的固定位置，因此红色部分的面积，可能完全进入峰面积积分值内，也可能完全不进入，也可能部分进入。因此这个峰面积就会有这个红色部分大小的固定随机误差。
为什么这个随机误差是固定大小，不随着峰面积大小而变化呢？其实这个说法是有一定条件的，就是峰宽必须是不变的。只要峰宽不变，基线噪声宽度也不变，那么这个面积就是固定的了。对于某个组分来说，只要色谱柱没有超载，无论这个组分的浓度是多少，峰宽就是一定的。所以，在不超载的情况下，也就是绝大多数情况下，这个随机误差都是固定的了。
这个固定误差非常关键。因为在不同浓度下，这个误差是固定的，所以测量点带上这个固定误差，就相当于下图中的红色方块了。本来理想的响应曲线，或者说我们标定得到的工作曲线，应该是绿色线。但因为单次测量存在这样一个固定的误差，因此我们在最不幸的情况下可能实际得到的是蓝色和粉色线。

蓝色线是标样浓度比较低的情况下得到的；粉色线是标样浓度比较高的情况下得到的。可以明显看到，粉色线更接近绿色的理想标线。这是因为浓度高，这个固定的随机误差相对就非常小，极端情况对标线的影响就很小了。
这个情况对我们来说很重要。因为一旦因标定时标准组分峰面积的随机误差而发生标线偏移，这个随机误差会被标线所固化，成为样品分析中的系统误差。也就是说，会在每一次分析中出现，而且实际样品浓度越大，偏离越远。
所以我们据此得到了标准样浓度的第三个要求，就是浓度应该在线性区间的较高浓度部分。注意，为了避免到达定量上限，应该与定量上限保持一定差值。
好了，这里我们得到了一些很好的结论，即标准样品中浓度的问题，我们需要总结一下了。这个结论就是：
标准样品浓度应该在定量下限和定量上限之间，并且更靠近定量上限。
我知道这个结论对很多朋友来说很难接受，甚至是颠覆性的。因为我在太多的朋友处看到，他们的色谱标准样品浓度都是很低的，一般都是控制指标要求的控制浓度。在很多情况下，这个控制浓度非常接近定量下限，而不是上限。朋友们都说，“我这个标样就是控制指标的，样品的峰面积比标样大，就是不合格；比标样小，就合格。这样的标样才准确可靠。”
这个想法是好的，但现实是残酷的。因为每次分析，峰面积都存在一个固定的基线噪声导致的面积误差，因此哪怕你重复分析两次标样，你也无法得到两个相同的峰面积。这时你会发现，用高浓度标样标定的曲线，分析结果的可能最大误差要小于用低浓度标定的分析结果。如上图中的粉色方块（粉色标线的极限误差）和蓝色方块（蓝色标线的极限误差）。
所以，当我们选择单点标定的时候，请尽量不要选择过低的浓度，因为这样分析结果的误差大。
4、进样量等的相对误差。
好了，我们继续讨论。影响标定的，还有进样量、检测器漂移、分流比变化等条件导致的相对误差。
我们知道，这些色谱条件其实都不是固定的。每次进样，进样量总是会有一个微小的误差，检测器响应也可能随着各种条件发生一点点差异。这个差异的绝对大小并不固定，而是和样品中组分含量密切相关。组分含量大，这个差异也就会被相应的放大一点；组分含量小，这个差异也就相应小一点。
这样看，这个误差对标定没什么影响。因为浓度高，误差就大，极端情况的影响是一样的。所以，这个相对误差确实不影响我们对标样浓度的选择，考虑标样浓度的时候我们可以忽略掉。
且慢。当我们正确选择了高浓度标样之后，固定误差已经很小可以忽略的时候，这个相对误差才是我们标定的主要误差来源，一样会固化在标线中成为系统误差，我们如何能够不在乎它呢？
哦，我们其实非常在乎这个随机误差的。只不过这个误差对我们的影响不是标样浓度，是标定方式。我们知道，随机误差服从正态分布，多次测量取平均值，可以有效减小随机误差。所以，要减小这个随机误差的影响，许多进行多次标定，并取平均值。从理论上来说，标定次数多多益善；但从实际工作强度来看，这个次数越少越好。因此我们必须折衷。在数学统计学上看，20次即可认为是无限多次，6次即可认为是有限的无限多次。所以，我建议标定的时候选择6平行。

这个图上面是随机误差t分布表达公式。u是真实值，x是多次分析的平均值，t是t分布表值（就是图下面表里面的值，与测量次数和置信度有关），s是样本偏差，n是测量次数。这个公式后面的ts/根号n就是多次测量平均值的随机误差了。
计算一下就会知道，在95%置信度下，当方法的s保持不变的情况下，2平行的随机误差大约是9s，6平行的随机误差大约是1s，6平行的随机误差要小10倍左右，即低一个数量级。而这正是我们所需要的：标定结果要比分析结果的随机误差小一个数量级。
只有这样，才能保证标定随机误差固化在标线内之后变成的系统误差，对实际样品分析结果的影响可以忽略。因为它要小一个数量级了。
所以，新的结论出来了，这就是：
标线标定要连续重复标定6次，取平均值，制作标线。
可能这个结果也是朋友们难以接受的。很多朋友把标样放在色谱仪旁边，什么时候觉得色谱仪需要标定了，就马上进样标定一次，然后根据标定结果改变标线。他们说：“我刚刚用标样标过的，绝对可靠。”很可惜，因为仅仅标定了一次，所以实际上是非常的不可靠，随机误差非常的大。
我费劲力气，终于和一个朋友讲明白了这个道理。他说：“啊。。。皮皮鱼，你这样是害我啊，按你说，我每次都要重复6次，那我还做不做样了，我整天都忙乎标定色谱了。”哦，不是的，不是这样的。其实，色谱仪没大的变化，仅仅是你对色谱长时间工作有些怀疑的时候，你不需要标定色谱，你只需要检验标线即可。所谓检验标线，就是进样分析一次标准样品，得到的结果与标称值相比，在允许的误差范围内，就说明标线仍然有效。所以，当你对标线有怀疑的时候，还是只要进样分析一次标准样品就好了。而且，你还不需要用这个结果重新制作标线，因为老的标线更可靠，所以你比以前省事了。只有当误差超过允许范围，才需要再次标定色谱仪。当然，定期，例如每半年，标定一次色谱仪也是极好的。多标定，总是没坏处。
所以，我们要记得：定期标定色谱仪，随时抽查检验标线。
好像到这里，外标法标定的事情就说完了呢！哦，不，还有要考虑的事项。
5、标准样品的准确性。
相信我，这是个严重问题。标样的标称浓度并不是非常可靠的，也有误差，或者说不确定度。好的厂家生产的每瓶标样上面都标有不确定度。什么U=2%，k=2啥的。这个k=2，表明是95%的置信度。这个U=2%，表明不确定度为2%。什么是不确定度呢？嗯。。。其实就是误差吧，另一种说法而已。就是说，这个标样，生产出来，浓度值的随机误差是2%。
如果你仔细看标样说明书，就会发现，浓度越低，组分越罕见，这个U就越大，甚至达到10%、20%。我的天，这个随机误差是要被固化在标线中，成为样品分析的系统误差的，光标样就有10%的系统误差，而且是我们无法消除的系统误差，这如何得了？
所以，我们需要帮助标准气生产厂家，不让他们为难。定制高浓度的标准气，生产厂家明显会轻松很多，U会小很多。
所以，我们又得到一个结论：高浓度的标准气，拥有更低的标称值随机误差。
二、内标法和归一化法的标定。
其实，内标法和归一化法，主要是标定相对校正因子。只要考虑对了单位，定标准气的时候单位正确，其他和外标法标定并没有什么差别。关于色谱分析结果的单位，可以参考我前些日字发的帖子。
哈！没想到收尾来的这么快吧？这个问题我讨论完了，收工了！
最后，让我们把这些结论温习一下：
1、当我们选择单点标定的时候，请尽量不要选择过低的浓度，因为这样分析结果的误差大。
2、标线标定要连续重复标定6次，取平均值，制作标线。
3、定期标定色谱仪，随时抽查检验标线。
4、高浓度的标准气，拥有更低的标称值随机误差。
最后，谈一下多点标定。其实，多点标定，每一个点，相当于单点标定中的一个平行。6个点制作曲线，相当于单点6平行，所以很多时候我们都要求6点（带原点？）。不过，多点可以有效的确定线性区间，平衡大小浓度的误差差异，所以更有效。当然，如果6点曲线的每个点再来个6平行，就更佳了。好吧，如果你不怕被烦死的话。。。。。。

分
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