植物油中抗氧化剂液相色谱法方法改进

dinghuan1985

2017/08/31

私聊

气相色谱（GC）

植物油中抗氧化剂液相色谱方法改进

摘要：改进了高效液相色谱法测定植物油中叔丁基对羟基茴香醚（BHA），2,6-二叔丁基对甲酚（BHT），特丁基对苯二酚（TBHQ）和没食子酸丙酯（PG）的分析方法。液态油脂样品经过甲醇提取，冷冻分层后再冷冻离心，经氮吹浓缩后定容。提取液经Platisil ODS，5μm，250*4.6mm色谱柱分离，以甲醇，20mmol/L为流动相，梯度洗脱，二极管阵列检测器（DAD）进行检测，结合保留时间和DAD光谱进行定性分析，检测波长280nm。4种抗氧化剂在5-100mg/L浓度范围内线性良好，相关系数r²＞0.999，定量限（LOQ，S/N＞10）为10mg/kg，空白样品加标回收率为79%-98%。该方法可快速，准确的满足植物油中抗氧化剂检测的要求。
抗氧化剂能够防止或者延缓油脂氧化分解，变质，提高食品的稳定性。目前常用的合成抗氧化剂有叔丁基对羟基茴香醚（BHA），2,6-二叔丁基对甲酚（BHT），特丁基对苯二酚（TBHQ）和没食子酸丙酯（PG）等。由于过量食用此类抗氧化剂会对人体产生一定的危害，所以我国食品添加剂使用标准GB 2760-2014对此类合成抗氧化剂的的使用有一定的限值。目前我国抗氧化剂主要分析标准有GB 5009.32-2016等，主要的分析方法为液相色谱法，气相色谱法，气相色谱-质谱联用法和液相色谱-质谱联用法。标准使用乙腈提取，SPE净化柱净化，操作繁琐，不适合批量检测。流动相使用0.5%甲酸水和甲醇，与苯甲酸等防腐剂测试流动相体系不同，更换流动相体系费时费力，增加了同一台仪器测试不同项目的测试成本。
本文参考了NY/T 1602-2008前处理方法，色谱分析流动相用乙酸铵水溶液替代甲酸水溶液，测试植物油中4种抗氧化剂含量的方法。
1 实验部分

仪器与试剂

Agilent1100液相色谱仪带DAD检测器；冷冻台式高速离心机（湘仪，H1850）；电子分析天平；涡旋混合器（IKA ，VORTEX 2）；氮吹仪（ANPEL ，DC24H）。
叔丁基对羟基茴香醚（BHA，纯度≥99.0%），2,6-二叔丁基对甲酚（BHT，纯度≥99.0%），特丁基对苯二酚（TBHQ，纯度≥99.5%），没食子酸丙酯（PG，纯度≥99.0%）均购自Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇（HPLC级，J.T.Baker）；乙酸铵（优级纯，国药集团）；实验用水为GB/T 6682规定的一级水。

标准溶液的配制
标准储备液：准确称取适量4种抗氧化剂标准品，分别用甲醇配成浓度为1000mg/L的储备液，置于棕色瓶中，-18℃冰箱保存备用。
混合标准工作液：分别移取上述标准储备液各1mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容，然后再用甲醇分别稀释成5，10，20，50，100mg/L的混合标准工作液。
样品前处理

称取2.000g样品于15mL离心管中，加入5mL甲醇，涡旋混匀5min，-18℃冷冻30min，以5000r/min离心5min，吸出上清液，再用甲醇提取一次。合并提取液用氮吹仪于50℃下浓缩至近干，用甲醇定容到2mL，过滤膜后备用。

色谱条件
色谱柱：Platisil ODS，5μm，250*4.6mm；流速：1.0mL/min；柱温：；检测波长：280nm；进样体积：10μL。流动相：A，甲醇；B，乙酸铵水溶液。梯度洗脱程序见下表1：

表1

时间（min）	溶剂A（%）	溶剂B（%）	时间（min）	溶剂A（%）	溶剂B（%）
0.00	20	80	11.00	90	10
2.00	20	80	17.00	90	10
6.00	80	20	17.10	20	80
10.00	80	20	20.00	20	80

结果与讨论
- 提取次数的选择
  经试验测得，甲醇单次提取油脂中4种抗氧化剂的回收率均在86%以上，两次提取回理论收率在95%以上，考虑到分层后甲醇可能无法完全吸取干净，实际实验回收率在79%-98%。因此在能够满足实验要求的基础上，简化流程，提高测试效率，选择使用甲醇作为提取液两次提取。
- 流动相的选择
  标准和文献中多采用甲酸水溶液或者乙酸水溶液，甲醇作为流动相体系，本文比较了乙酸水溶液-甲醇和乙酸铵水溶液-甲醇2种流动相体系对抗氧化剂分离效果的影响。结果表明，乙酸水溶液-甲醇和乙酸铵水溶液-甲醇两种体系均可较好的分离4种抗氧化剂，且对抗氧化剂的分离效果无明显的区别。考虑到不同测试项目对流动相体系的要求，为了减少流动相体系的切换带来的仪器效率降低，本文最终选择乙酸铵水溶液-甲醇作为流动相体系。
  
  图1：使用乙酸水溶液和甲醇为流动相
  
  图2：使用乙酸铵水溶液和甲醇为流动相
  
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  图3：样品加标
  
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