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大肠杆菌在扫描电镜中的制样方法

钟友梅

2017/09/05

扫描电镜（SEM/EDS）

扫描电镜（SEM）是介于透射电镜和光学显微镜之间的一种微观性貌观察手段，可直接利用样品表面材料的物质性能进行微观成像。扫描电镜的优点是，①有较高的放大倍数，20-20万倍之间连续可调；②有很大的景深，视野大，成像富有立体感，可直接观察各种试样凹凸不平表面的细微结构；③试样制备简单。目前的扫描电镜都配有X射线能谱仪装置，这样可以同时进行显微组织性貌的观察和微区成分分析，因此它是当今十分有用的科学研究仪器。
对于扫描电镜我也仅是局限于对基本操作略知一二，其更专业的相关知识知之甚少，碰巧最近接了一个用扫面电镜观察大肠杆菌的实验，就借此机会互相讨论学习一下大肠杆菌在描电镜观察中的制样方法。
制样过程可大体分为四步：
1、取样：取大量样品离心（转速3000r-4000r)，去除上清液，加入适当PH（7.2-7.4）的1XPBS清洗三遍；清洗时，菌体温柔悬浮，离心，去上清。
1、固定：2.5%戊二醛固定3h(1-12都可），离心，之后用PBS清洗三遍，离心，去上清。
2、脱水用乙醇水溶液按30%、50%、70%、80%、90%的浓度梯度对样品进行脱水，每步约15min，离心，之后在100%乙醇中脱水15minX2次，离心，去上清，再将样品置于乙醇和叔丁醇1:1的混合液中15min，去上清；然后用纯叔丁醇置换酒精2次,每次15min,最后吸取混匀的细菌-叔丁醇悬浮液滴在盖玻片上。
3、干燥载有样品的盖玻片置-80℃冰箱冷冻后，放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥。
4、喷金样品充分干燥后，将盖玻片粘附到贴好导电胶带的样品台上，镀金。
5、电镜下观察。
附图:

制样过程比较简单，但是比较耗时，特别是脱水的过程。制样过程有多次离心，为防止多次离心后大肠杆菌样品损失过多，离心要充分，并且倾倒上清液时要小心缓慢，防止倒出样品。另外，冷冻的叔丁醇特别容易液化，将载有大肠杆菌-叔丁醇悬浮液的盖玻片拿出低温冰箱后要迅速放入冷冻干燥机内进行冷冻干燥。
通过此次实验既学到了细菌在扫面电镜观察下的制样过程，又学习了扫面电镜的使用及其操作细节和注意事项，令我受益匪浅。

附件：

大肠杆菌在扫描电镜观察中的制样方法.doc

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海润Kevin

第1楼2017/09/05

好做品，加油

0

驰奔仪器

第2楼2017/09/07

学习收藏，给楼主点赞

0

vivi

第3楼2017/09/11

拍的不错，期待更漂亮的作品。

0

一颗蒲公英

第4楼2017/09/13

穿透太严重了，不过你这台电镜老古董了。

0

fengyonghe

第5楼2017/09/17

高压太高了

0

mengzhaocheng

第6楼2017/09/18

应助达人

好多啊，第一次看到大肠杆菌的图片

0

断刀客森

第7楼2017/10/12

样品前处理时，100%乙醇脱水后可直接使用临界点干燥仪来干燥，可简化制样步骤，省时。
电镜图穿透太厉害，牺牲了样品细节。所以电镜拍照，使用低电压观测，可以呈现更好的图片效果，

0

Insp_de2338ca

第8楼2018/09/11

请问，菌液大概要取多少毫升啊？

0

wildonkey

第9楼2018/10/10

电压好高菌体都成半透明的

0

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