中文摘要：目的 确立因子类血液制品中蛋白质含量对效价检测结果的影响，从而完善因子类血液制品效价检测的方法。方法 选取不同蛋白质浓度梯度的稀释液对同一供试品进行稀释来确定蛋白质影响的规律。 结果 建立起人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物的全自动血凝仪因子效价检测方法，根据效价检测反应体系中蛋白浓度对检测结果的影响,建立因子类血液制品效价全自动血凝仪检测的方法。结论 建立的两种稀释方法均消除了样品中蛋白质含量的不同对检测结果的影响，提高了检测的准确性，不但可以适用于现在产品的效价检测，而且适用于随着生产工艺的提升生产的更高纯度、低蛋白含量的FⅧ和PCC，同时也是对中国药典标准的补充。
关键词：人凝血因子Ⅷ；人凝血酶原复合物；效价；蛋白含量
人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物、人凝血因子Ⅸ等因子类血液制品，是以健康人血浆为原料，经分离纯化和病毒灭活制成，在临床上主要用于各种凝血因子缺乏的治疗，这些因子类血液制品的凝血因子效价是药品有效性的指标，凝血因子效价的测定也是药品质量检测中的关键检测项目。血液制品生产企业及各级检测机构一般采用全自动血凝仪并按照仪器使用说明来进行因子效价的检测，然而在不同检测方法结果比对中，发现全自动血凝仪检测结果与中国药典中一期法的检测结果在部分因子效价检测中存在检测差异，差异可能是样品稀释中使用的稀释液的蛋白含量不同引起的，故本课题主要研究因子类血液制品中蛋白质含量对效价检测结果影响。通过蛋白含量对因子效价检测影响的研究建立起的全自动血凝仪因子效价检测方法，消除了产品本身性质的影响，可以准确进行因子效价的测定，方法的建立不但可以准确控制因子类血液制品的质量，保证生产企业持续稳定生产出质量均一的药品，而且可以减少因子类产品在临床使用中的风险。
1 实验仪器与试剂
1.1 仪器
Stago-compact全自动血凝仪（法国Diagnostica Stago公司），漩涡振荡器（美国Thermo Scientific公司）。
1.2 试剂
人凝血因子Ⅷ缺乏血浆（法国Diagnostica Stago公司），人凝血因子Ⅸ缺乏血浆（法国Diagnostica Stago公司），APTT试剂（法国Diagnostica Stago公司），Owren-Koller（稀释液）（法国Diagnostica Stago公司），0.025 mol/L氯化钙溶液（法国Diagnostica Stago公司），Desorb U（清洗液）（法国Diagnostica Stago公司），人凝血因子Ⅷ国家标准品（批号20100101），人凝血酶原复合物国家标准品（批号20130306），生理氯化钠溶液（石家庄四药有限公司），咪唑（天津市巴斯夫化工有限公司），氯化钠（天津市巴斯夫化工有限公司），枸橼酸钠（台山新宁制药有限公司），人血白蛋白（公司自产）。
2 方法
2.1 人凝血因子Ⅷ不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定
人凝血因子Ⅷ国家标准品的定标：取1支人凝血因子Ⅷ国家标准品，加入1.0 ml纯化水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，将Desorb U（清洗液）、复溶后的人凝血因子Ⅷ缺乏血浆、0.025 mol/L氯化钙溶液、APTT以及每1 ml含1.00 IU的人凝血因子Ⅷ标准品溶液分别装入全自动血凝仪的试剂抽屉，将Owren-Koller（稀释液）装入全自动血凝仪的样本抽屉，按照《Stago-compact全自动血凝仪标准操作规程》选择人凝血因子Ⅷ效价测定定标程序进行定标，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅷ标准品溶液再进行2倍、4倍、8倍稀释，建立人凝血因子Ⅷ标准品溶液效价（分别为1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml）的对数对其相应凝固时间对数的直线回归方程。
不同蛋白质浓度梯度稀释液制备：选取全自动血凝仪的稀释液Owren-Koller、生理氯化钠溶液、取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合液分别定义为稀释液1、稀释液2、稀释液3。向3种稀释液中分别加入人血白蛋白，使其中人血白蛋白的浓度分别为0、0.5%、1%、3%、5%。
人凝血因子Ⅷ供试品效价测定：取人凝血因子Ⅷ供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，再用含不同蛋白浓度的稀释液做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅷ效价测定选项进行测定。
2.2 人凝血因子Ⅷ人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定
人凝血因子Ⅷ国家标准品的定标：取1支人凝血因子Ⅷ国家标准品，加入1.0 ml纯化水复溶，轻轻混匀，用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆将其稀释成每1ml含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，将Desorb U（清洗液）、复溶后的人凝血因子Ⅷ缺乏血浆、0.025 mol/L氯化钙溶液、APTT以及每1 ml含1.00 IU的人凝血因子Ⅷ标准品溶液分别装入全自动血凝仪的试剂抽屉，将Owren-Koller（稀释液）装入全自动血凝仪的样本抽屉，按照《Stago-compact全自动血凝仪标准操作规程》选择人凝血因子Ⅷ效价测定定标程序进行定标，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅷ标准品溶液再进行2倍、4倍、8倍稀释，建立人凝血因子Ⅷ标准品溶液效价（分别为1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml）的对数对其相应凝固时间对数的直线回归方程。
人凝血因子Ⅷ供试品效价测定：取人凝血因子Ⅷ供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，再用Owren-Koller（稀释液）做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅷ效价测定选项进行测定。
2.3 人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定
人凝血因子Ⅸ国家标准品的定标：取1支人凝血酶原复合物国家标准品，加入1.0 ml纯化水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，将Desorb U（清洗液）、复溶后的人凝血因子Ⅸ缺乏血浆、0.025 mol/L氯化钙溶液、APTT以及每1 ml含1.00 IU的人凝血因子Ⅸ标准品溶液分别装入全自动血凝仪的试剂抽屉，将Owren-Koller（稀释液）装入全自动血凝仪的样本抽屉，按照《Stago-compact全自动血凝仪标准操作规程》选择人凝血因子Ⅸ效价测定定标程序进行定标，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅸ标准品溶液再进行2倍、4倍、8倍稀释，建立人凝血因子Ⅸ标准品溶液效价（分别为1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml）的对数对其相应凝固时间对数的直线回归方程。
不同蛋白质浓度梯度稀释液制备同2.1。
人凝血酶原复合物供试品效价测定：取人凝血酶原复合物供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，再用含不同蛋白浓度的稀释液做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅸ效价测定选项进行测定。
2.4 人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定
人凝血因子Ⅸ国家标准品的定标：取1支人凝血酶原复合物国家标准品，加入1.0 ml纯化水复溶，轻轻混匀，用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆将其稀释成每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，将Desorb U（清洗液）、复溶后的人凝血因子Ⅸ缺乏血浆、0.025 mol/L氯化钙溶液、APTT以及每1 ml含1.00 IU的人凝血因子Ⅸ标准品溶液分别装入全自动血凝仪的试剂抽屉，将Owren-Koller（稀释液）装入全自动血凝仪的样本抽屉，按照《Stago-compact全自动血凝仪标准操作规程》选择人凝血因子Ⅸ效价测定定标程序进行定标，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅸ标准品溶液再进行2倍、4倍、8倍稀释，建立人凝血因子Ⅸ标准品溶液效价（分别为1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml）的对数对其相应凝固时间对数的直线回归方程。
人凝血酶原复合物供试品效价测定：取人凝血酶原复合物供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，再用Owren-Koller（稀释液）做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅸ效价测定选项进行测定。
3 结果
3.1 人凝血因子Ⅷ不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定结果
选取2015ZK0801批人凝血因子Ⅷ进行了不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定，不同浓度稀释液分别测定10次。人血白蛋白的浓度分别为0、0.5%、1%、3%、5%的稀释液1、稀释液2、稀释液3的效价检测结果分别见表1、2、3，效价检测结果为效价标示量的百分比。
表1 FⅧ质控品不同蛋白浓度梯度稀释液1检测结果
表2 FⅧ质控品不同蛋白浓度梯度稀释液2检测结果
表3 FⅧ质控品不同蛋白浓度梯度稀释液3检测结果
人凝血因子Ⅷ质控品2015ZK0801批用不同蛋白质浓度梯度的稀释液1、稀释液2、稀释液3稀释效价检测结果平均值用折线图表示，如图1：
图1 FⅧ质控品不同蛋白质浓度检测结果对比
选取2批国外产人凝血因子Ⅷ和VWF混合制剂进行了不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定，人血白蛋白的浓度分别为0、0.5%、1%、3%、5%的稀释液1、稀释液2、稀释液3的效价检测结果见表4、5，效价检测结果为效价标示量的百分比。
表4 658668A批制剂FⅧ检测结果
表5 A3B1814批制剂FⅧ检测结果
FⅧ效价检测结果用折线图表示，如图2、3：
图2 658668A批不同蛋白质浓度检测结果对比
图3 A3B1814批不同蛋白质浓度检测结果对比
3.2 人凝血酶原复合物不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定结果
选取2015ZK0901批人凝血酶原复合物进行了不同蛋白质浓度梯度稀释人凝血因子Ⅸ效价测定，不同浓度稀释液分别测定10次。人血白蛋白的浓度分别为0、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%的稀释液1、稀释液2、稀释液3的效价检测结果分别见表6、7、8，效价检测结果为效价标示量的百分比。
表6 PCC质控品不同蛋白浓度梯度稀释液1检测结果
表7 PCC质控品不同蛋白浓度梯度稀释液2检测结果
表8 PCC质控品不同蛋白浓度梯度稀释液3检测结果
人凝血酶原复合物质控品2015ZK0901批用不同蛋白质浓度梯度的稀释液1、稀释液2、稀释液3稀释FⅨ效价检测结果平均值用折线图表示，如图4：
图4 PCC质控品不同蛋白质浓度FⅨ检测结果对比
3.3 人凝血因子Ⅷ人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定结果
选取2015ZK0801批人凝血因子Ⅷ进行了人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定，共测定10次。效价检测结果见表9，效价检测结果为效价标示量的百分比。
表9 FⅧ质控品人凝血因子缺乏血浆稀释检测结果
选取2批国外产人凝血因子Ⅷ和VWF混合制剂进行了人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定。效价检测结果见表10，效价检测结果为效价标示量的百分比。
表10 国外产品人凝血因子缺乏血浆稀释检测结果
3.4 人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定结果
选取2015ZK0901批人凝血酶原复合物进行了人凝血因子缺乏血浆稀释人凝血因子Ⅸ效价测定，共测定10次。效价检测结果见表11，效价检测结果为效价标示量的百分比。
表11 PCC质控品人凝血因子缺乏血浆稀释检测结果
4 讨论
本实验中对人凝血因子Ⅷ和人凝血酶原复合物分别用不同蛋白浓度梯度的稀释液进行了效价测定，另外用人凝血因子缺乏血浆稀释后进行了效价测定。因子效价测定中，稀释液1、稀释液2、稀释液3中加入相同浓度的人血白蛋白后，得到的因子效价检测结果没有差异，说明全自动血凝仪的稀释液Owren-Koller、生理氯化钠溶液、取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合液作为稀释液时没有区别。
人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物不同蛋白浓度梯度效价测定时，随着稀释液中蛋白质含量的增高，效价检测结果也不断升高，但在人凝血因子Ⅷ效价测定中，采用蛋白质含量为1%、3%的稀释液时，效价检测结果间均无显著差别，在人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ效价测定中，采用蛋白质含量为0、0.5%、1%的稀释液时，效价检测结果间均无显著差别。另外，人凝血因子Ⅷ进行人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定效价检测结果与采用蛋白质含量为1%、3%的稀释液得到的检测结果也无显著差异，人凝血酶原复合物人凝血因子缺乏血浆稀释人凝血因子Ⅸ效价检测结果与采用蛋白质含量为0、0.5%、1%的稀释液得到的检测结果也无显著差异。另外，国外生产的人凝血因子Ⅷ和VWF的混合制剂FⅧ效价的检测结果及血浆、稀释液的影响同泰邦公司产品一致。
参考文献
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