温度和时间对葡萄皮渣中多酚提取的影响

hhciq

2017/09/20

私聊

食品安全/营养与健康

温度和浸提时间对葡萄皮渣中多酚提取的影响
摘要 用70%乙醇以1∶6的固液比浸提葡萄皮渣，比较不同温度及不同浸提时间对浸提效果的影响。结果表明多酚的最佳浸提温度为70℃，最佳浸提时间为12小时；白藜芦醇的最佳浸提温度为50℃，最佳浸提时间为24小时。
关键词 葡萄皮渣；多酚；白藜芦醇；温度；时间
多酚物质是指芳香环上直接连有多个羟基的酚类及其聚合物的总称。由于它们具有多种生理功能，对植物多酚的提取一直是研究的热点。葡萄皮渣作为酿酒的废弃物，含有7%-8%的多酚，具有较大开发潜力。采用醇溶法浸提皮渣中的多酚，主要有四个影响因素：浸提物料比、酒精浓度、提取温度及浸提时间。目前，对茶叶多酚的提取研究较多，如杜晓，何春雷做的浸取方法对茶叶中多酚类浸出状况影响的研究，就是从这四个因素着手，采取二次回归旋转设计法，得出了茶多酚的最佳提取模型。安保礼等人对悬钩子叶中的多酚进行多次浸提时，浸提时间也是一个重要的影响因素。尹莲浸提茶多酚采用的是70℃水浴浸提1h。在对葡萄皮渣多酚的提取研究中，时间和温度也是两个必须考虑的影响因素。该实验以1∶6的固液比、70%的酒精浓度浸提为固定条件,并参照他人的实验方法，设计本实验方案，考察浸提时间和温度对浸提效果的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
原料：酿酒后的葡萄皮渣废料经自然晒干后粉碎成末状，葡萄品种为黑比诺，其中葡萄籽约占皮渣干重的42%。
试剂：钨酸钠（上海试剂厂）、钼酸钠（成都金堂精化厂）、硫酸锂（西安试剂厂）、浓盐酸（西安试剂厂）、浓磷酸（西安试剂厂）、无水碳酸钠（焦作化工三厂）、无水乙醇（西安试剂厂）、五倍子酸（遵义市第二化工厂），以上均为分析纯；白藜芦醇标样（Sigma公司）、甲醇（西安试剂厂）、乙腈（西安试剂厂），以上均为色谱纯。
仪器：SSY6型恒温水浴锅（北京泰克仪器有限公司）；SHHW21600型三用恒温水浴锅（上海医疗器械厂）；F2102植物试样粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；岛津UV-1700型分光光度计（SHIMADZU公司）；JA1203型电子天平（上海天平仪器厂）；TGL·16G型高速台式离心机（上海医用分析仪器厂）；日本岛津公司组合型高效液相色谱仪；AS3120B型超声波清洗机；真空抽气瓶；1810B型自动双重纯水蒸馏器；冷凝回流装置；其他常用器具。
1.2 实验方法
1.2.1工艺流程
原料→粉碎→称取10.000g→70%乙醇在不同温度、不同时间的条件下，以1∶6的固液比浸提→过滤→比色→分析
1.2.2测定方法
1.2.2.1 多酚：Folin-Ciocalteu比色法
Folin-Ciocateu试剂的制备：100g钨酸钠+25g钼酸钠+700mL水→2L圆底烧瓶中→50mL85%磷酸+100mL盐酸→文火回流10h→50mL蒸馏水冲洗冷凝管→加150g硫酸锂及几滴溴水→煮沸15min→冷却后定容至1L
比色：滤液稀释10倍→取1mL于100mL容量瓶中→加蒸馏水50mL→加入Folin-Ciocalteu试剂5mL→加入饱和碳酸钠15mL→定容→静置两小时后比色
2 白藜芦醇：高效液相色谱法
将重蒸水经0.45um超滤、脱气；乙腈超声波脱气后备用。先将样品高速离心（9000r/min，10min），滤液离心后，取上清液经0.45um超滤、脱气后待测。测定时的色谱条件：固定相VP-ODSC₁₈柱，流动相采用乙腈∶水（40∶60），流速1mL/min，检测波长306nm，柱温为室温，每次进样10μL。
1.2.3多酚及白藜芦醇的标准曲线测定
准确称取0.500g五倍子酸，溶于100mL水中，取6支100mL的容量瓶，按下表配制成0~500mg/L标准溶液，用Folin-Ciocalteu比色法测定其在765nm波长处的吸光度，得下表：

标液	1	2	3	4	5	6
酚浓度y（mg/L）	0	50	100	150	250	500
吸光度x（A）	0	0.058	0.119	0.189	0.334	0.684

建立回归方程： y=8.33787+722.52x 相关系数：ｒ=0.9996^**
同理，可用高效液相色谱法得到白藜芦醇的回归方程：
y=―1667.96+38059.4x 其中 y:峰面积 x:浓度
相关系数：ｒ=0.99998^**
1.2.4 计算
多酚提取率（%）=（提取量/总含量）×100%
多酚（白藜芦醇）得率（%）=（提取量/原料重量）×100%
2 结果分析
2.1 浸提时间对浸提效果的影响
由表1可以看出，葡萄皮渣中的多酚浸提12h提取量最多（三次共有483.2mg），提取率达到最高（61.2%），之后由于长时间受热可能引起多酚缩合略有降低（连续三次浸提24h提取总量为471.6mg），但也可看出，浸提时间对提取效果的影响并不十分显著。随着提取次数的增加，提取量迅速下降，后一次的提取量约为前一次的一半或更少，第三次的提取量仅为几十毫克。而且经过三次浸提，提取率已达50-60%，对工业生产而言两到三次浸提已足够。

表1不同浸提时间对多酚浸提效果的影响

序号	浸提时间（h）	第一次（mg）	第二次（mg）	前两次（mg）	第三次（mg）	三次和（mg）	提取率（%）	得率（%）
1	4	317.8	104.1	421.9	41.7	463.6	58.7	4.64
2	8	317.9	83.0	400.9	38.0	438.9	55.6	4.39
3	12	222.5	171.3	393.8	89.4	483.2	61.2	4.83
4	24	319.0	105.9	424.9	46.7	471.6	59.7	4.72

注：1.以上每个样本均为常温下浸提10g皮渣； 2.数据均为两个重复之平均值

表2 不同浸提时间对白藜芦醇浸提效果的影响

序号	浸提时间（h）	第一次（mg）	第二次（mg）	前两次（mg）	第三次（mg）	三次和（mg）	得率（%）
1	4	0.350	0.151	0.501	0.030	0.531	0.0053
2	8	0.030	0.110	0.140	——	0.140	0.0014
3	12	0.186	0.152	0.338	0.098	0.436	0.0044
4	24	0.418	0.122	0.540	0.036	0.576	0.0058

注：1.以上每个样本均为常温下浸提10g皮渣；2.空格表明未检测出
由表２可以看出，对皮渣中的白藜芦醇来说，浸提时间对提取量的影响并未体现出明显的规律性，但根据表中直观显示，连续三次提取总量从多到少依次是24h、4h、12h、8h。同时，浸提次数增加，提取量迅速下降，到第三次不足0.1mg，无需再次浸提。从得率上看，24h，4h较高，但也仅为0.0058%和0.0053%，说明皮渣中的白藜芦醇含量较低，一方面葡萄中的白藜芦醇含量本身就低，另一方面多数已在酿造过程中进入到酒中。
2.2 浸提温度对浸提效果的影响

表3 不同浸提温度对多酚浸提效果的影响

序号	浸提温度（℃）	第一次（mg）	第二次（mg）	前两次（mg）	第三次（mg）	三次和（mg）	提取率（%）	得率（%）
1	室温	317.8	104.1	421.9	41.7	463.6	58.7	4.64
2	40	342.8	96.6	439.4	45.0	484.4	61.4	4.84
3	50	341.8	111.3	453.1	44.3	497.4	63.0	4.97
4	60	314.5	165.0	479.5	65.4	544.9	69.0	5.45
5	70	333.6	176.1	509.7	82.5	592.2	75.0	5.92

注：1.以上每个样本均为10g皮渣浸提12小时；2.数据均为两个重复之平均值
由表3可知，在第一、第二、第三次浸提时，随温度上升，提取量总体是上升的。三次总的提取率由室温的58.7%，上升到70℃的75.0%，比较明显。70℃的提取量比室温、40℃、50℃、60℃分别增加了128.6mg、107.8mg、94.8mg、47.3mg，可见温度的变化明显的影响着浸提效果。同时可以看出，在70℃下连续三次浸提12h的提取量占总含量的75%，可认为是工业生产较适宜的温度。

表4 不同浸提温度对白藜芦醇浸提效果的影响

序号	浸提温度（℃）	第一次（mg）	第二次（mg）	前两次（mg）	第三次（mg）	三次和（mg）	得率（%）
1	室温	0.350	0.151	0.501	0.030	0.531	0.0053
2	40	0.029	0.127	0.156	0.026	0.182	0.0018
3	50	0.469	0.226	0.695	0.025	0.720	0.0072
4	60	0.021	0.299	0.320	0.141	0.461	0.0046
5	70	0.323	0.216	0.539	0.103	0.642	0.0064

注：1、以上每个样本均为10g皮渣浸提12小时。
从表4可以看出，对葡萄皮渣中的白藜芦醇来说，直观显示为50℃效果较好（10g皮渣中共提取白藜芦醇0.720mg），但是各组数据并不能显示出明显的规律。而且，第三次浸提的提取量不足0.1mg，因此可认为这时皮渣中大部分的白藜芦醇已被浸提出来。
3 结论与讨论
3.1葡萄皮渣中的多酚，在以1∶6的固液比，70%乙醇浸提的前提下，比较合适的浸提温度与浸提时间分别为70℃、12h；白藜芦醇的比较合适的浸提温度为50℃，浸提时间为24h。
3.2 有关白藜芦醇的数据缺乏规律性，原因可能是含量太少，轻微的操作误差即引起结果的较大波动；也可能是该物质在葡萄皮渣中分布不够均一，10g的供试量太少，导致重复之间不具备可比性。
3.3 由于实验条件限制以及其他因素的影响，使得实验也存在部分误差：如手工过滤时酒精的挥发；实验进行大部分之后发现4个比色皿中的一个的吸光值高出其他三个0.025左右；不同操作者存在差异等。